Proteinstruktur und N-terminale Sequenzanalyse
Von der Aminosäuresequenz bis zur gefalteten Kette: die Strukturebenen der Proteine, die Kräfte, die sie zusammenhalten, und die Bestimmung der N-terminalen Aminosäure nach Sanger und Edman.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Primärstruktur eines Proteins ist seine Aminosäuresequenz, die Sekundärstruktur umfasst α-Helix und β-Faltblatt, die über Rückgrat-Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden.
- Die Raumstruktur stabilisieren Disulfidbrücken (kovalent), Ionenbindungen, Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen, Esterbindungen dagegen nicht.
- 1-Fluor-2,4-dinitrobenzen reagiert per nucleophiler aromatischer Substitution mit der freien N-terminalen Aminogruppe; nach saurer Hydrolyse erhält man die DNP-Aminosäure.
- Der Edman-Abbau mit Phenylisothiocyanat spaltet pro Zyklus die N-terminale Aminosäure als PTH-Derivat ab und lässt das Restpeptid intakt.
- DNP-Isoleucin ist am β-C verzweigt und trägt dort ein zweites Stereozentrum, Valin ist am β-C symmetrisch verzweigt, Leucin erst am γ-C.
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Worum es geht
Insulin wirkt nur in seiner richtig gefalteten Form, und diese Faltung ergibt sich aus der Reihenfolge seiner Aminosäuren. Zur Strukturaufklärung von Peptiden gehört deshalb, die Sequenz chemisch vom N-Terminus her zu bestimmen.
Strukturebenen
Proteine sind Polypeptide, also lange Ketten aus Aminosäuren, verknüpft über Peptidbindungen. Ihre Struktur beschreibt man auf vier Ebenen.
- Primärstruktur: die Reihenfolge der Aminosäuren, also die Sequenz.
- Sekundärstruktur: regelmäßige Faltung des Rückgrats, vor allem α-Helix und β-Faltblatt.
- Tertiärstruktur: die räumliche Faltung der ganzen Kette.
- Quartärstruktur: der Verbund mehrerer Ketten, etwa der vier Untereinheiten im Hämoglobin.
In der Helix windet sich die Kette wie eine Schraube. Im Faltblatt liegen gestreckte Abschnitte nebeneinander. Beide Formen halten Wasserstoffbrücken zwischen den C=O- und N–H-Gruppen des Rückgrats zusammen.
Stabilisierung der Raumstruktur
Tertiär- und Quartärstruktur entstehen vor allem durch Wechselwirkungen der Seitenketten. Nur eine davon ist kovalent.
| Wechselwirkung | Art | Beispiel |
|---|---|---|
| Disulfidbrücke | kovalent | zwei Cystein-Reste, –S–S– |
| Ionenbindung (Salzbrücke) | nichtkovalent | \(\ce{-NH3+}\) von Lysin mit \(\ce{-COO-}\) von Aspartat |
| Wasserstoffbrücke | nichtkovalent | Serin-OH mit Rückgrat-C=O |
| hydrophobe Wechselwirkung | nichtkovalent | Leucin- und Phenylalanin-Reste im Inneren |
Unpolare Reste sammeln sich im Inneren des Proteins, weil Wasser sie aus seinem Netzwerk verdrängt. Esterbindungen tragen anders als diese vier nicht zur Raumstruktur bei. Zwischen den Seitenketten eines Proteins werden keine Ester geknüpft.
Sanger- und Edman-Abbau
Beide Verfahren greifen an der freien Aminogruppe des N-Terminus an. Sie ist nucleophil, während die übrigen Stickstoffatome des Rückgrats in Amidbindungen gebunden sind.
Sanger-Reagenz
1-Fluor-2,4-dinitrobenzen reagiert mit dem N-Terminus in einer nucleophilen aromatischen Substitution. Die beiden Nitrogruppen aktivieren den Ring, Fluorid verlässt ihn (R = Peptidrest).
\[\ce{R-NH2 + F-C6H3(NO2)2 -> R-NH-C6H3(NO2)2 + HF}\]
Anschließend hydrolysiert man mit Säure alle Peptidbindungen. Die Aryl-N-Bindung übersteht das. Die N-terminale Aminosäure liegt danach als N-(2,4-Dinitrophenyl)-Aminosäure vor, kurz DNP-Aminosäure. Das übrige Peptid ist dabei zerstört.
Edman-Abbau
Schrittweiser Abbau eines Peptids vom N-Terminus mit Phenylisothiocyanat: Pro Zyklus wird genau eine Aminosäure abgespalten, das Restpeptid bleibt erhalten.
- Addition: \(\ce{Ph-N=C=S}\) addiert im schwach Basischen an die Aminogruppe. Es entsteht ein Phenylthiocarbamoyl-Peptid.
- Abspaltung: Im wasserfreien Sauren greift der Schwefel die erste Peptidbindung an. Die N-terminale Aminosäure löst sich als Thiazolinon.
- Umlagerung: Das Thiazolinon lagert sich zum stabilen Phenylthiohydantoin (PTH) um, das man chromatographisch identifiziert.
- Nächster Zyklus: Das verkürzte Peptid durchläuft die Schritte erneut.
Phenylisothiocyanat baut Peptide also ab. Zum Knüpfen von Peptidbindungen dienen andere Reagenzien (Peptidsynthese).
DNP-Isoleucin erkennen
DNP-Aminosäuren unterscheiden sich nur in der Seitenkette. Lies sie vom α-C aus und zähle, wo die Kette verzweigt (aliphatische Aminosäuren).
| DNP-Derivat | Seitenkette | Kennzeichen |
|---|---|---|
| Isoleucin | \(\ce{-CH(CH3)CH2CH3}\) | Verzweigung am β-C, dort zweites Stereozentrum |
| Valin | \(\ce{-CH(CH3)2}\) | Verzweigung am β-C, zwei gleiche Methylgruppen |
| Leucin | \(\ce{-CH2CH(CH3)2}\) | Verzweigung erst am γ-C |
| Methionin | \(\ce{-CH2CH2SCH3}\) | unverzweigt, Thioether-Schwefel |
In der Keilstrichformel zeigt DNP-Isoleucin daher zwei Stereozentren, am α-C und am β-C.
Quiz
Aussage 1
Nach der Umsetzung mit Sanger-Reagenz und saurer Hydrolyse steht das verkürzte Peptid für einen weiteren Abbauzyklus zur Verfügung.
Die saure Hydrolyse spaltet alle Peptidbindungen. Nur der Edman-Abbau lässt das Restpeptid intakt und erlaubt weitere Zyklen.
Aussage 2
Esterbindungen zwischen Seitenketten zählen neben Disulfidbrücken zu den kovalenten Bindungen, die die Tertiärstruktur von Proteinen stabilisieren.
Esterbindungen sind an der Raumstruktur nicht beteiligt. Die einzige kovalente Stabilisierung ist die Disulfidbrücke zwischen Cystein-Resten.
Aussage 3
DNP-Isoleucin unterscheidet sich von DNP-Valin durch ein zusätzliches Stereozentrum am β-C-Atom der Seitenkette.
Am β-C des Isoleucins sitzen Methyl, Ethyl, H und das α-C. Valin trägt dort zwei gleiche Methylgruppen und ist daher nicht chiral.
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