UV-Detektion in der HPLC und fehlender Chromophor
Wann ein Arzneistoff im UV-Detektor der HPLC sichtbar ist, welche Trennungen die RP-HPLC leistet und wie man Stoffe ohne Chromophor trotzdem erfasst.
Das Wichtigste in Kürze
- Der UV-Detektor misst die Absorption des HPLC-Eluats bei fester Wellenlänge zerstörungsfrei und erfasst nur Stoffe mit Chromophor.
- An RP-18 trennen sich Ampicillin und Amoxicillin, Ampicillin und sein Diketopiperazin, Keton und Alkohol sowie Diastereomere ohne chirale Phase.
- Ein negativer Peak nahe der Totzeit entsteht, wenn die Injektionslösung schwächer absorbiert als das Fließmittel, und ist kein Cotton-Effekt.
- Gesättigte Stoffe wie Glycerol, Sorbitol, Dimethylamin und Fosfomycin absorbieren oberhalb 220 nm nicht, Cyclohexanon und 1,3-Cyclohexadien dagegen schon.
- Für Fosfomycin-Calcium eignet sich ein Verdampfungs-Lichtstreudetektor; Dimethylamin wird nach Derivatisierung mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzen als gelbes Dinitroanilin UV-detektierbar.
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Worum es geht
Die meisten Arzneibuchmethoden zur Reinheitsprüfung arbeiten mit RP-HPLC und einem UV-Detektor. Das funktioniert aber nur, wenn der Stoff einen Chromophor besitzt. Polyole wie Sorbitol oder Glycerol bleiben unsichtbar und brauchen einen anderen Detektor oder eine chemische Markierung.
Trennungen mit UV-Detektion
Der UV-Detektor ist der Standarddetektor der HPLC. Das Eluat strömt durch eine kleine Durchflussküvette, die Licht einer festen Wellenlänge durchstrahlt, oft 254 nm. Der Detektor misst die Absorption und zeichnet sie gegen die Zeit auf. Nach dem Lambert-Beer-Gesetz ist das Signal der Konzentration proportional.
Die Messung zerstört den Analyten nicht. Man kann das Eluat hinter dem Detektor also auffangen und den Stoff zurückgewinnen, etwa in der präparativen HPLC.
Getrennt wird auf der Säule, nicht im Detektor. An Octadecylkieselgel (RP-18) bleiben unpolare Stoffe länger haften, polare eluieren früher. Schon kleine Strukturunterschiede verschieben deshalb die Retentionszeit:
| Stoffpaar | Strukturunterschied | Ergebnis an RP-18 |
|---|---|---|
| Ampicillin / Amoxicillin | Amoxicillin trägt eine zusätzliche phenolische OH-Gruppe | verschiedene Retentionszeiten |
| Ampicillin / sein Diketopiperazin | Abbauprodukt mit geöffnetem β-Lactam und neuem Sechsring | verschiedene Retentionszeiten |
| Keton / entsprechender Alkohol | C=O gegen CH–OH | unterscheidbar |
| Salsalat und Acetylsalsalat in ASS | Ester-Verunreinigungen der Acetylsalicylsäure | als Verunreinigungen erfassbar |
| Diastereomere | verschiedene physikalische Eigenschaften | trennbar mit achiraler mobiler Phase |
Diastereomere unterscheiden sich in Polarität und Löslichkeit. Sie trennen sich deshalb schon an einer achiralen RP-18-Phase mit achiraler mobiler Phase. Enantiomere dagegen verhalten sich in achiraler Umgebung identisch und brauchen eine chirale Phase.
Wird im Examen gerne gefragt: Die RP-HPLC unterscheidet Ampicillin von Amoxicillin und von seinem Diketopiperazin, Keton von Alkohol und erfasst Salsalat in ASS. Achte bei Diastereomeren darauf, dass eine achirale RP-18-Phase mit achiraler mobiler Phase genügt.
Manchmal erscheint kurz nach der Injektion ein Signal unterhalb der Basislinie. Der Detektor ist gegen das Fließmittel abgeglichen. Enthält die Injektionslösung ein Lösungsmittel mit kleinerem Absorptionskoeffizienten, absorbiert diese Zone schwächer, und der Peak zeigt nach unten. Mit dem Cotton-Effekt hat das nichts zu tun, denn dieser beschreibt Banden im CD-Spektrum chiraler Stoffe.
Stoffe ohne Chromophor
Ein UV-Detektor sieht nur Stoffe mit einem Chromophor, also einem π-System. Gesättigte Verbindungen kennen nur σ→σ- und n→σ-Übergänge. Diese liegen unterhalb von etwa 200 bis 220 nm, wo auch die Fließmittel selbst absorbieren (Cut-off). Für die Detektion ist dieser Bereich praktisch unbrauchbar.
Die Cyclohexan-Reihe zeigt das Prinzip. Cyclohexan, Cyclohexanol und Cyclohexylmethylether haben oberhalb 220 nm kein Maximum, denn OH- und Ethergruppen sind nur Auxochrome. Erst die Carbonylgruppe des Cyclohexanons liefert eine schwache n→π*-Bande um 285 nm. Das konjugierte 1,3-Cyclohexadien absorbiert stark um 256 nm.
So prüfst du eine Strukturformel:
- π-Systeme suchen: C=C, C=O, Aromaten, Nitro- oder Azogruppen.
- Konjugation prüfen: Je ausgedehnter, desto langwelliger und stärker die Bande.
- Rest bewerten: Nur Einfachbindungen mit OH, OR, \(\ce{NR2}\) oder Halogen bedeuten keinen nutzbaren Chromophor.
- Detektor ableiten: Mit Chromophor UV-Detektor, ohne Chromophor ein universeller Detektor oder Derivatisierung.
Typische Arzneibuchstoffe ohne nutzbaren Chromophor sind:
| Stoffgruppe | Beispiele |
|---|---|
| Alkohole, Polyole | Propan-2-ol, Glycerol, Sorbitol, Panthenol |
| Ether, Alkane, Halogenalkane | Diethylether, Petrolether, einfache Halogenalkane |
| Amine, Aminoalkohole | Dimethylamin, Tropanole wie Tropin und Pseudotropin |
| Sonstige | Fosfomycin, Guanethidin (nur kurzwelliges UV) |
Propan-2-ol und Petrolether zeigen daher auch zwischen 250 und 260 nm keine Bande. Tropin und Pseudotropin lassen sich im UV-Vis nicht unterscheiden.
Glycerol und Wasser absorbieren bei 240 nm beide nicht. Deshalb liefern reines Glycerol (100 %) und Glycerol 85 % dort dasselbe Ergebnis. Den Wassergehalt verrät die UV-Messung nicht. Ebenso wenig erfasst eine HPLC mit UV-Detektion bei 254 nm Sorbitol und verwandte Polyole. Für Sorbitol nutzt man andere Verfahren, etwa die Karl-Fischer-Titration für Wasser und die Leitfähigkeitsmessung für sauer reagierende Verunreinigungen.
Fosfomycin besitzt ebenfalls keinen Chromophor. Auf DC-Platten mit F254 löscht es die Fluoreszenz nicht (Detektion auf der DC). Für Fosfomycin-Calcium eignet sich ein Verdampfungs-Lichtstreudetektor besser als ein UV/Vis-Detektor. Auch 589 nm hilft nicht weiter: Die Natrium-D-Linie ist eine atomare Linie und weist gelöste Natriumsalze in der Molekülspektroskopie nicht nach.
Nur Einfachbindungen und freie Elektronenpaare: im UV-Detektor unsichtbar. Ein Chromophor braucht π-Elektronen.
Derivatisierung
Wenn kein universeller Detektor zur Verfügung steht, kann man dem Analyten den fehlenden Chromophor chemisch anhängen.
Gezielte Umsetzung eines Analyten mit einem Reagenz, das eine nachweisbare Gruppe einführt, etwa einen Chromophor für die UV/Vis-Detektion. Das Produkt wird statt des Ausgangsstoffs gemessen.
Dimethylamin ist ein Beispiel. Es reagiert mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzen, dem Sanger-Reagenz, in einer nucleophilen aromatischen Substitution:
\[\ce{(CH3)2NH + C6H3F(NO2)2 -> (CH3)2N-C6H3(NO2)2 + HF}\]
Das Amin greift den fluortragenden Kohlenstoff an. Die beiden Nitrogruppen stabilisieren die negativ geladene Meisenheimer-Zwischenstufe, dann tritt Fluorid aus.
Das Produkt N,N-Dimethyl-2,4-dinitroanilin ist gelb. Die Aminogruppe wirkt als Donor, die Nitrogruppen als Akzeptoren. So entsteht ein Push-Pull-Chromophor mit starker, langwelliger Absorption. Man kann sich das Reagenz wie ein Leuchtetikett vorstellen, das man einem unsichtbaren Molekül anheftet. Danach lässt sich Dimethylamin per HPLC mit UV/Vis-Detektor bestimmen.
Quiz
Aussage 1
Ein nach unten gerichtetes Signal kurz nach der Injektion, verursacht durch ein schwächer absorbierendes Lösungsmittel der Probe, wird als Cotton-Effekt bezeichnet.
Der negative Peak entsteht, weil die Injektionszone schwächer absorbiert als das Fließmittel. Der Cotton-Effekt betrifft CD-Spektren chiraler Stoffe.
Aussage 2
Nach Umsetzung mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzen lässt sich Dimethylamin per HPLC mit UV/Vis-Detektor bestimmen.
Die Derivatisierung erzeugt das gelbe N,N-Dimethyl-2,4-dinitroanilin mit einem Push-Pull-Chromophor.
Aussage 3
Ampicillin und Amoxicillin zeigen an einer RP-18-Säule dieselbe Retentionszeit, weil sie sich nur in einer Hydroxygruppe unterscheiden.
Die zusätzliche phenolische OH-Gruppe macht Amoxicillin polarer. An RP-18 haben beide daher unterschiedliche Retentionszeiten.
Aussage 4
Cyclohexanon besitzt oberhalb von 220 nm ein Absorptionsmaximum, Cyclohexanol dagegen nicht.
Die Carbonylgruppe liefert eine schwache n→π*-Bande um 285 nm. Die OH-Gruppe des Cyclohexanols ist kein Chromophor.
Aussage 5
Zwei Diastereomere lassen sich an einer achiralen RP-18-Phase mit achiraler mobiler Phase trennen.
Diastereomere unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften. Nur Enantiomere brauchen eine chirale Umgebung.
Aussage 6
Glycerol 85 % lässt sich von reinem Glycerol durch Absorptionsmessung bei 240 nm unterscheiden.
Weder Glycerol noch Wasser absorbieren bei 240 nm. Beide Proben liefern daher dasselbe Ergebnis.
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