Detektionsverfahren in der HPLC
Welche Detektoren in der HPLC zum Einsatz kommen, wie UV-, PDA-, elektrochemischer und Lichtstreudetektor arbeiten und wann Fließmittel und Analyt für die UV-Detektion taugen.
Das Wichtigste in Kürze
- HPLC-Detektoren erfassen die getrennten Stoffe im Eluat über Absorption, Fluoreszenz, Brechzahl, Redoxverhalten, Streulicht oder Masse.
- UV/Vis-, Fluoreszenz-, Brechungsindex- und amperometrischer Detektor sind RP-tauglich, der FID ist für die RP-HPLC prinzipiell ungeeignet.
- Bei 232 nm sind Wasser, Methanol, n-Hexan und Cyclohexan als Fließmittel geeignet, Toluen absorbiert selbst und scheidet aus.
- Estradiol (Phenolring) absorbiert bei etwa 280 nm, Testosteronpropionat (Enon) stark bei etwa 240 nm.
- Der PDA-Detektor zerlegt das Licht erst nach der Zelle auf Hunderte Photodioden und liefert für eine Substanz Peaks gleicher Retentionszeit mit wellenlängenabhängiger Höhe.
- Der ELSD verdampft die mobile Phase, erfasst Stoffe ohne Chromophor, ist gradiententauglich und liefert ein nichtlineares Signal.
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Worum es geht
Ein Detektor macht die in der Säule getrennten Stoffe erst sichtbar. Welcher Detektor passt, hängt davon ab, ob der Analyt UV-Licht absorbiert, fluoresziert oder redoxaktiv ist und ob das Fließmittel mitspielt. In der Arzneimittelprüfung entscheidet diese Wahl darüber, ob ein Wirkstoff wie Estradiol überhaupt quantifizierbar ist.
Detektoren im Überblick
Nach der Trennsäule muss ein Detektor erkennen, wann ein Stoff das Eluat passiert. Er nutzt eine Eigenschaft, in der sich der Analyt von der mobilen Phase unterscheidet. Pumpe, Injektor und Säule davor behandelt die Seite zur HPLC-Anlage.
| Detektor | Messgröße | Typischer Einsatz |
|---|---|---|
| UV/Vis-Photometer, PDA | Lichtabsorption | Standard für Analyten mit Chromophor |
| Fluoreszenzdetektor | emittiertes Licht nach Anregung | Fluorophore, sehr empfindlich |
| Differentialrefraktometer (RI) | Brechzahlunterschied zur Referenz | universell, nur isokratisch |
| Elektrochemischer (amperometrischer) Detektor | Strom bei Oxidation oder Reduktion | redoxaktive Stoffe |
| ELSD | Streulicht der Analytpartikel | Stoffe ohne Chromophor |
| Massenspektrometer | Masse-Ladungs-Verhältnis | Identifizierung, Spuren |
Alle Verfahren der Tabelle funktionieren auch in der RP-HPLC, also mit wässrig-organischen Fließmitteln an Umkehrphasen. Das gilt für UV- und PDA-Detektor ebenso wie für Fluoreszenz- und amperometrischen Detektor. Die Grundlagen von Fluoreszenz und Brechzahl stehen auf eigenen Seiten.
Der Flammenionisationsdetektor (FID) stammt aus der Gaschromatographie. Er verbrennt organische Stoffe in einer Wasserstoffflamme und misst die entstehenden Ionen. In der RP-HPLC würde schon das Methanol oder Acetonitril des Fließmittels ein riesiges Dauersignal liefern. Der Analyt ginge darin unter. Dass der FID für die HPLC an Umkehrphasen prinzipiell ungeeignet ist, Photometrie, Fluorimetrie, Refraktometrie und Amperometrie dagegen eingesetzt werden, wird im Examen gerne gefragt.
Überraschend, aber etabliert ist die direkte Kopplung mit einem \(\ce{^{1}H}\)-NMR-Spektrometer (LC-NMR). Das Eluat fließt durch eine Messzelle im Magnetfeld. Die Protonensignale des Fließmittels unterdrückt man mit deuterierten Lösungsmitteln oder speziellen Pulsfolgen. So erhält man zu einem Peak direkt Strukturinformation.
UV-Detektion und Eluenten
Der UV-Detektor ist das Arbeitspferd der HPLC. Er funktioniert nur, wenn das Fließmittel bei der Messwellenlänge kaum absorbiert. Sonst liegt die Basislinie hoch und kleine Peaks gehen im Rauschen unter. Kennzahl ist der UV-Cutoff: die Wellenlänge, unterhalb der das Lösungsmittel selbst zu stark absorbiert.
| Fließmittel | UV-Cutoff etwa | bei 232 nm |
|---|---|---|
| Wasser | 190 nm | geeignet |
| Acetonitril | 190 nm | geeignet |
| n-Hexan | 195 nm | geeignet |
| Cyclohexan | 200 nm | geeignet |
| Methanol | 205 nm | geeignet |
| Toluen | 285 nm | ungeeignet |
Wasser, Methanol und die gesättigten Kohlenwasserstoffe besitzen nur σ-Bindungen und freie Elektronenpaare. Ihre Übergänge liegen unter etwa 210 nm. Toluen trägt dagegen einen aromatischen Ring, dessen \(\pi\to\pi^*\)-Banden weit ins mittlere UV reichen. Bei 232 nm absorbiert es daher selbst und ist als Komponente der mobilen Phase unbrauchbar. Gelöster Sauerstoff färbt das Fließmittel nicht. Er stört höchstens im kurzwelligen UV, der Bereich von 400 bis 500 nm bleibt auswertbar. Warum man trotzdem entgast, erklärt die Seite zu Elution und Entgasung.
Ein Fließmittel taugt für die UV-Detektion nur, wenn sein Cutoff deutlich unter der Messwellenlänge liegt. Aromatische Lösungsmittel scheiden im mittleren UV aus.
Auf der anderen Seite braucht der Analyt einen Chromophor, also eine Struktur, die UV-Licht absorbiert. Die Übergänge dahinter erklärt die Seite zu Chromophoren. Zwei Steroide zeigen, wie verschieden das ausfällt. Estradiol besitzt einen phenolischen, aromatischen Ring A und absorbiert bei etwa 280 nm. Dort absorbiert es stärker als Testosteronpropionat. Testosteronpropionat trägt ein α,β-ungesättigtes Keton (Enon) und absorbiert stark bei etwa 240 nm. Im sichtbaren Bereich (420 bis 780 nm) absorbieren beide nicht nennenswert, beide sind farblos.
Auch Proteine sind UV-aktiv. Ihre aromatischen und heteroaromatischen Aminosäuren wie Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan absorbieren um 254 nm. Für die Säulenchromatographie von Proteinen genügt deshalb ein einfacher Detektor: eine Quecksilber-Niederdrucklampe mit ihrer intensiven Linie bei 253,7 nm und ein 254-nm-Filter.
Photodiodenarray-Detektor
Ein klassischer UV-Detektor misst bei einer einzigen, vorher gewählten Wellenlänge. Der Photodiodenarray-Detektor (PDA, DAD) nimmt stattdessen zu jedem Zeitpunkt ein ganzes Spektrum auf.
UV/Vis-Detektor, der mit einer Zeile aus Hunderten Photodioden die Absorption eines ganzen Wellenlängenbereichs gleichzeitig erfasst.
Der Trick liegt in der umgekehrten Optik. Das polychromatische Licht einer Deuteriumlampe durchstrahlt zuerst die Durchflusszelle. Erst danach zerlegt ein Gitter das durchgelassene Licht und verteilt es auf die Diodenzeile. Jede Diode empfängt einen schmalen Wellenlängenbereich. Die Photodioden registrieren Licht, sie senden selbst keines aus. Man kann sich die Zeile wie ein Lineal aus Lichtsensoren vorstellen, auf das ein Regenbogen fällt.
Weil nichts mechanisch verstellt wird, dauert ein komplettes UV/Vis-Spektrum nur Sekundenbruchteile. Über einen Peak entstehen so viele Spektren. Addiert man sie rechnerisch, mittelt sich das zufällige Rauschen heraus und das Signal-Rausch-Verhältnis steigt.
Aus den gespeicherten Daten lassen sich Chromatogramme bei mehreren Wellenlängen gleichzeitig ausgeben. Für dieselbe Substanz erscheinen dann deckungsgleiche Peaks mit gleicher Retentionszeit. Sie unterscheiden sich nur in der Höhe, die der Absorption bei der jeweiligen Wellenlänge folgt.
Besonders prüfungsrelevant: Bei mehreren Detektionswellenlängen liefert dieselbe Substanz Peaks mit identischer Retentionszeit und unterschiedlicher Höhe. Die Wellenlänge ändert also die Signalhöhe, nie die Lage des Peaks.
Bei zwei verschiedenen Stoffen ändert sich mit der Wellenlänge auch das Peakhöhenverhältnis, denn ihre Absorptionsspektren sind verschieden. Bei 240 nm dominiert der Peak von Testosteronpropionat, bei 280 nm der von Estradiol.
Grenzen setzt der Chromophor. Ethanol besitzt nur σ-Bindungen und freie Elektronenpaare am Sauerstoff. Es absorbiert erst unterhalb von etwa 210 nm, wo auch die Fließmittel stören. Mit einem PDA-Detektor ist Ethanol daher kaum erfassbar. Für solche Stoffe eignen sich Brechungsindexdetektor oder ELSD.
Elektrochemische Detektion
Der elektrochemische Detektor arbeitet meist amperometrisch. An der Arbeitselektrode liegt ein festes Potential. Erreicht ein redoxaktiver Analyt die Elektrode, wird er oxidiert oder reduziert. Der fließende Strom ist der Konzentration proportional. Das Messprinzip erklärt die Seite zu amperometrischen Sensoren.
Die Messzelle enthält drei Elektroden. In der Dünnschicht-Durchflusszelle liegen sich Arbeits- und Hilfselektrode in einem schmalen Kanal gegenüber, getrennt nur durch eine dünne Dichtung. Das Eluat strömt als dünner Film zwischen ihnen hindurch. Die Referenzelektrode sitzt stromabwärts im Auslass. An diesem Bild erkennt man eine Querschnittsskizze als amperometrische Dünnschichtzelle.
Der Messstrom fließt zwischen Arbeits- und Hilfselektrode. Die Referenzelektrode bleibt praktisch stromlos und hält nur das Potential der Arbeitselektrode konstant.
Im Oxidationsmodus erfasst man leicht oxidierbare Stoffe. Typisch sind o-Diphenole (Brenzcatechine) wie Adrenalin oder Dopamin. Sie werden zu o-Chinonen oxidiert und geben dabei zwei Elektronen ab:
\[\ce{R-C6H3(OH)2 -> R-C6H3O2 + 2H+ + 2e-}\]
Im Reduktionsmodus nimmt der Analyt Elektronen auf. So lassen sich Nitroaromaten reduktiv detektieren.
Ob ein Reaktionsschema eine Oxidation zeigt, prüfst du am Edukt: Es verliert Wasserstoff oder gewinnt Sauerstoff, die Oxidationszahl eines Atoms steigt. Umgekehrt sind die Spaltung eines Disulfids zu Thiolen, die Hydrierung eines Aromaten zum Cyclohexan und die Umwandlung eines Phenols in den Aromaten ohne OH-Gruppe Reduktionen.
Lichtstreudetektor
Viele Stoffe besitzen keinen Chromophor, etwa Zucker oder Lipide. Für sie gibt es den Verdampfungs-Lichtstreudetektor (ELSD, evaporative light scattering detector).
Detektor, der die mobile Phase vollständig verdampft und das Licht misst, das die zurückbleibenden Analytpartikel streuen.
- Zerstäuben: Ein Stickstoffstrom zerstäubt das Eluat zu feinen Tröpfchen.
- Verdampfen: Im beheizten Driftrohr verdampft die mobile Phase vollständig. Übrig bleiben Partikel des schwerer flüchtigen Analyten.
- Streulicht messen: Die Partikel kreuzen einen Lichtstrahl. Ein Detektor im Winkel zum Strahl erfasst das Streulicht.
Weil nur die Partikel streuen, erfasst der ELSD auch Substanzen ohne Chromophor. Das Fließmittel ist vor der Messung verschwunden. Deshalb ist der ELSD, anders als der Brechungsindexdetektor, mit Gradientenelution kompatibel. Pufferzusätze müssen allerdings flüchtig sein.
Das Signal hängt nichtlinear von der Konzentration ab, denn die Streuintensität folgt der Partikelgröße. Man kalibriert deshalb über mehrere Punkte, oft doppeltlogarithmisch. Wie in jeder HPLC muss der Analyt gelöst vorliegen. Proben mit ungelöstem Analyten lassen sich auch mit dem ELSD nicht analysieren.
LC-MS-Kopplung
Die Kopplung mit einem Massenspektrometer verbindet Trennung und Identifizierung. Die Reihenfolge der Bauteile ist fest:
- HPLC: trennt das Gemisch.
- Elektrospray-Ionisation (ESI): überführt die gelösten Analyten bei Atmosphärendruck in Ionen.
- Massenanalysator: etwa ein Flugzeitanalysator (TOF), trennt die Ionen nach m/z.
- Sekundärelektronenvervielfacher (SEV): steht als eigentlicher Detektor am Ende und verstärkt den Ionenstrom.
Die Chlorisotope \(\ce{^{35}Cl}\) und \(\ce{^{37}Cl}\) unterscheidet erst das Massenspektrometer. In der HPLC eluieren die Isotopologen gemeinsam und geben keine getrennten Signale. Ionisation und Analysatoren behandelt die Seite zur LC-MS-Kopplung.
Quiz
Aussage 1
Adrenalin wird am elektrochemischen Detektor im Reduktionsmodus erfasst.
Als o-Diphenol wird Adrenalin oxidativ zum o-Chinon umgesetzt. Reduktiv detektiert man zum Beispiel Nitroaromaten.
Aussage 2
Der ELSD kann mit Gradientenelution betrieben werden.
Die mobile Phase wird vor der Messung vollständig verdampft, ihre wechselnde Zusammensetzung stört daher nicht.
Aussage 3
Der Flammenionisationsdetektor eignet sich gut für die HPLC an Umkehrphasen.
Der FID würde die organischen Anteile der mobilen Phase mitverbrennen und ein riesiges Untergrundsignal liefern. Er ist für die RP-HPLC prinzipiell ungeeignet.
Aussage 4
Toluen ist bei UV-Detektion um 232 nm eine gut geeignete Komponente der mobilen Phase.
Toluen absorbiert als Aromat selbst im mittleren UV (Cutoff etwa 285 nm). Geeignet sind bei 232 nm etwa Wasser, Methanol, n-Hexan oder Cyclohexan.
Aussage 5
Bei etwa 280 nm absorbiert Estradiol stärker als Testosteronpropionat.
Der phenolische Ring A des Estradiols absorbiert um 280 nm. Das Enon des Testosteronpropionats hat sein starkes Maximum bei etwa 240 nm.
Aussage 6
Im PDA-Detektor durchstrahlt polychromatisches Licht die Durchflusszelle, bevor ein Gitter es auf die Diodenzeile zerlegt.
Diese umgekehrte Optik erlaubt die gleichzeitige Erfassung eines ganzen Wellenlängenbereichs durch Hunderte Photodioden.
Aussage 7
Eine HPLC lässt sich direkt mit einem \(\ce{^{1}H}\)-NMR-Spektrometer koppeln.
Bei der LC-NMR fließt das Eluat durch eine Messzelle im Magnetfeld, Fließmittelsignale werden unterdrückt.
Aussage 8
Zeichnet ein PDA-Detektor dieselbe Substanz bei zwei Wellenlängen auf, erscheinen die Peaks bei unterschiedlichen Retentionszeiten.
Die Peaks sind deckungsgleich und haben dieselbe Retentionszeit. Nur ihre Höhe unterscheidet sich mit der Absorption bei der jeweiligen Wellenlänge.
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