Trennstufenzahl und Trennstufenhöhe
Wie man aus Retentionszeit, Peakbreite und Säulenlänge die Trennstufenzahl N und die Trennstufenhöhe H berechnet und was beide über die Effizienz einer Säule aussagen.
Das Wichtigste in Kürze
- Das Bodenmodell zerlegt eine Säule gedanklich in \(N\) theoretische Böden der Höhe \(H\), in denen sich jeweils ein Verteilungsgleichgewicht einstellt.
- Die Trennstufenzahl berechnet man mit \(N = 5{,}54\,(t_R/w_h)^2\) aus der Halbwertsbreite oder mit \(N = 16\,(t_R/w_b)^2\) aus der Basisbreite.
- Schmalere Peaks bei gleicher Retentionszeit bedeuten ein höheres \(N\). Peakhöhe und Detektionswellenlänge beeinflussen \(N\) nicht.
- \(N\) und \(H\) beschreiben die Effizienz einer Säule, nicht die Trennung zweier Analyten. Dafür sind Trennfaktor und Auflösung zuständig.
- Die Trennstufenhöhe ist \(H = L/N\). Man braucht dazu Säulenlänge, Retentionszeit und Halbwertsbreite. Je kleiner \(H\), desto höher die Trennleistung.
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Worum es geht
Wie gut eine chromatographische Säule arbeitet, zeigt sich an der Breite ihrer Peaks. Trennstufenzahl und Trennstufenhöhe machen daraus eine Zahl. Damit vergleicht man Säulen und prüft HPLC-Methoden für Arzneistoffe auf ihre Leistungsfähigkeit.
Bodenmodell
Das Bodenmodell stammt aus der Destillation. Dort besteht eine Kolonne aus echten Böden, auf denen sich Dampf und Flüssigkeit jeweils ins Gleichgewicht setzen. In der Chromatographie überträgt man dieses Bild gedanklich auf die Säule. Man zerlegt sie in gleich hohe Scheiben. In jeder Scheibe verteilt sich der Analyt einmal zwischen mobiler und stationärer Phase.
Ein theoretischer Boden ist der gedachte Säulenabschnitt, in dem sich genau ein Verteilungsgleichgewicht des Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase einstellt. Er ist kein reales Bauteil, sondern eine Modell- und Rechengröße.
Eine Säule der Länge \(L\) enthält nach diesem Modell \(N\) Böden der Höhe \(H\). Je mehr Gleichgewichtsschritte die Säule bietet, desto weniger verschmiert die Substanzzone auf ihrem Weg. Der Peak bleibt schmal.
Effizienz und Selektivität
Zwei Eigenschaften einer Trennung muss man auseinanderhalten. Die Effizienz beschreibt, wie schmal ein einzelner Peak bei gegebener Retentionszeit bleibt. Sie ist eine Eigenschaft von Säule und System und wird durch \(N\) und \(H\) erfasst.
Die Selektivität beschreibt, wie weit die Peakmaxima zweier Stoffe auseinanderliegen. Sie hängt von der Chemie der Phasen ab und wird durch den Trennfaktor erfasst. Ob zwei Peaks am Ende getrennt sind, beurteilt erst die Auflösung. Sie verbindet beide Eigenschaften.
Trennstufenzahl
Die Trennstufenzahl \(N\), auch Bodenzahl genannt, gibt an, wie viele theoretische Böden eine Säule bietet. Man berechnet sie aus einem einzigen Peak. Dazu braucht man seine Retentionszeit und seine Breite. Wie man beide abliest, steht unter Retentionszeiten.
\[N = 5{,}54 \cdot \left(\frac{t_R}{w_h}\right)^2 \qquad N = 16 \cdot \left(\frac{t_R}{w_b}\right)^2\]
| Größe | Bedeutung | Einheit |
|---|---|---|
| \(N\) | Trennstufenzahl | dimensionslos |
| \(t_R\) | Retentionszeit des Peaks | min oder s |
| \(w_h\) | Halbwertsbreite, Peakbreite auf halber Höhe | min oder s |
| \(w_b\) | Basisbreite zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der Basislinie | min oder s |
Beide Formeln sagen dasselbe. Für einen Gauß-Peak gilt \(N = (t_R/\sigma)^2\), mit der Standardabweichung \(\sigma\) des Peaks. Die Halbwertsbreite entspricht \(2{,}355\,\sigma\), die Basisbreite \(4\,\sigma\). Quadriert ergeben sich die Faktoren 5,54 und 16.
Statt Zeiten kann man auch Volumina einsetzen. Das Elutionsvolumen des Analyten und die Peakbreite in Millilitern liefern dasselbe \(N\).
Was N aussagt
Bei gleicher Retentionszeit bedeutet ein schmalerer Peak ein höheres \(N\). Die Säule arbeitet effizienter. Man kann sich die Substanzzone wie eine Gruppe Läufer vorstellen: In einer guten Säule kommen alle fast gleichzeitig ins Ziel. Verbessert sich die Effizienz, werden die Peaks schmaler, während die Maxima an derselben Stelle bleiben.
Die Peakhöhe ändert \(N\) nicht. Sie hängt von Menge und Absorption des Stoffes ab, nicht von Breite und Lage des Peaks. Aus demselben Grund spielt die Detektionswellenlänge keine Rolle. Die Rechnung funktioniert an jeder Säule, auch an einer chiralen stationären Phase.
Wird im Examen gerne gefragt: \(N\) charakterisiert die Effizienz einer Säule gegebener Länge, nicht die Trennung zweier Analyten. Achte darauf, dass nur Retentionszeit und Peakbreite eingehen, Peakhöhe und Wellenlänge dagegen nicht.
Rechenbeispiel
Ein Peak erscheint bei 6,0 min. Auf halber Höhe ist er 0,10 min breit.
- Ablesen: \(t_R = 6{,}0\) min, \(w_h = 0{,}10\) min.
- Quotient bilden: \(t_R/w_h = 60\). Beide Werte stehen in Minuten, der Quotient ist dimensionslos.
- Quadrieren: \(60^2 = 3600\).
- Faktor anwenden: \(N = 5{,}54 \cdot 3600 \approx 19\,900\).
Ein zweiter Peak im selben Lauf liegt bei 8,0 min mit \(w_h = 0{,}20\) min. Der Quotient ist 40, also \(N = 5{,}54 \cdot 1600 \approx 8900\). Er eluiert später, ist aber relativ zu seiner Lage breiter. Liest man die Basisbreite ab, rechnet man analog: Ein Peak bei 10 min mit \(w_b = 0{,}4\) min ergibt \(N = 16 \cdot 25^2 = 10\,000\).
Typische Fehler beim Rechnen:
- Der Faktor passt nicht zur Breite: 5,54 gehört zur Halbwertsbreite, 16 zur Basisbreite.
- Das Quadrat wird vergessen.
- Retentionszeit und Breite stehen in verschiedenen Einheiten, etwa Minuten und Sekunden.
Trennstufenhöhe
Die Trennstufenzahl wächst mit der Säulenlänge. Eine doppelt so lange Säule derselben Packung hat etwa doppelt so viele Böden. Um Säulen verschiedener Länge fair zu vergleichen, bezieht man deshalb auf die Länge. Das ergibt die Trennstufenhöhe \(H\), auch HETP genannt (height equivalent to a theoretical plate).
\[H = \frac{L}{N} = \frac{L}{5{,}54 \cdot (t_R/w_h)^2}\]
| Größe | Bedeutung | Einheit |
|---|---|---|
| \(H\) | Trennstufenhöhe (HETP) | mm oder µm |
| \(L\) | Säulenlänge | mm |
| \(N\) | Trennstufenzahl | dimensionslos |
Zur Bestimmung von \(H\) braucht man also drei Messgrößen: die Säulenlänge, die Retentionszeit und die Halbwertsbreite eines Peaks.
Kleine Böden, gute Säule
\(H\) und \(N\) sind umgekehrt proportional. Halbiert sich \(H\), verdoppelt sich bei gleicher Länge \(N\). Je kleiner die Trennstufenhöhe, desto höher die Trennleistung. Eine große HETP bedeutet umgekehrt eine schwache Säule. Bei gegebener Länge legt also \(H\) fest, wie leistungsfähig das System ist.
Auch die Halbwertsbreite wirkt direkt. Ein schmalerer Peak liefert ein größeres \(N\) und damit ein kleineres \(H\). Wie \(N\) beschreibt auch \(H\) die Effizienz, nicht die Trennung zweier Analyten. Das solltest du sicher können, ebenso die Richtung: großes \(N\), kleines \(H\), gute Säule.
\(H\) hängt von der Packung und den Laufbedingungen ab, etwa von Korngröße und Fließgeschwindigkeit. Mit der Säulenlänge nimmt \(H\) nicht zu, denn \(N\) wächst mit \(L\) im gleichen Maß. Proportional zur Nettoretentionszeit ist \(H\) ebenfalls nicht. Welche Prozesse \(H\) bestimmen, beschreibt die van-Deemter-Gleichung.
Rechenbeispiel
Der Peak aus dem vorigen Abschnitt stammt von einer 150 mm langen Säule.
- Trennstufenzahl übernehmen: \(N = 5{,}54 \cdot 3600 = 19\,944\).
- Länge einsetzen: \(H = 150\ \text{mm} / 19\,944 \approx 0{,}0075\) mm.
- Umrechnen: \(0{,}0075\ \text{mm} = 7{,}5\ \mu\text{m}\).
Typische Fehler sind der Kehrwert und die Einheit. \(H\) ist \(L\) geteilt durch \(N\), nicht umgekehrt. \(H\) hat die Einheit einer Länge, \(N\) ist dimensionslos. Werte von einigen Mikrometern sind für HPLC-Säulen plausibel. Eine Bodenhöhe im Zentimeterbereich deutet auf einen Rechenfehler hin.
Quiz
Aussage 1
Liest man statt der Halbwertsbreite die Basisbreite eines Peaks ab, verwendet man zur Berechnung von \(N\) den Faktor 16 statt 5,54.
Die Basisbreite entspricht \(4\,\sigma\), quadriert ergibt das 16. Zur Halbwertsbreite (\(2{,}355\,\sigma\)) gehört der Faktor 5,54.
Aussage 2
Eine Säule mit großer HETP hat eine höhere Trennleistung als eine gleich lange Säule mit kleiner HETP.
Umgekehrt: Je kleiner die Trennstufenhöhe, desto mehr Böden passen in die Säule und desto höher ist die Trennleistung.
Aussage 3
Um die HETP aus einem Chromatogramm zu bestimmen, benötigt man Säulenlänge, Retentionszeit und Halbwertsbreite des Peaks.
Aus \(t_R\) und \(w_h\) ergibt sich \(N\), mit der Säulenlänge folgt \(H = L/N\).
Aussage 4
Verlängert man eine Säule bei gleicher Packung auf das Doppelte, verdoppelt sich auch ihre Trennstufenhöhe.
Mit der Länge verdoppelt sich die Trennstufenzahl, die Trennstufenhöhe \(H = L/N\) bleibt gleich.
Aussage 5
Ein Peak mit \(t_R = 5{,}0\) min und \(w_h = 0{,}10\) min entspricht einer Trennstufenzahl von rund 13 850.
\(t_R/w_h = 50\), quadriert 2500, mal 5,54 ergibt 13 850.
Aussage 6
Die Trennstufenzahl gibt an, wie gut zwei bestimmte Analyten voneinander getrennt werden.
\(N\) charakterisiert die Effizienz der Säule anhand eines einzelnen Peaks. Die Trennung zweier Analyten beschreiben Trennfaktor und Auflösung.
Aussage 7
Wird bei unveränderter Peakbreite und Retentionszeit die doppelte Probenmenge injiziert, steigt die Trennstufenzahl, weil der Peak höher wird.
Die Peakhöhe geht nicht in \(N\) ein. \(N\) hängt nur von Retentionszeit und Peakbreite ab.
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