Selektivität und Spezifität von Analysenverfahren
Was Selektivität und Spezifität eines Analysenverfahrens bedeuten, warum die direkte UV-Photometrie weniger selektiv ist als die HPLC-UV und wann sich ein Arzneistoff photometrisch bestimmen lässt.
Das Wichtigste in Kürze
- Selektivität (Spezifität) ist die Fähigkeit eines Verfahrens, den Analyten neben Begleitsubstanzen richtig und präzise zu bestimmen, das Ergebnis ist von ihnen unabhängig.
- Störungen durch chemisch ähnliche Stoffe betreffen die Selektivität. Sie verschlechtern vor allem die Richtigkeit, die Präzision misst nur die Streuung.
- Die direkte UV-Photometrie erfasst die Summe aller Absorbanzen, mitabsorbierende Begleitstoffe führen zu überhöhten Gehalten.
- HPLC-UV ist selektiver, weil die chromatographische Trennung Analyt und Begleitstoffe vor dem Detektor auftrennt.
- Geeignete Messwellenlängen: Phenol etwa 280 nm, Diphenhydraminhydrochlorid 258 nm, Methamphetaminhydrochlorid 250 bis 260 nm, Benazepril 240 nm, Sulfanilamid 250 bis 350 nm.
Worum es geht
Ein Gehaltswert ist nur so gut wie die Gewissheit, dass wirklich nur der Analyt gemessen wurde. Die Selektivität beschreibt genau das. Sie entscheidet in der Arzneimittelprüfung, ob ein einfaches UV-Photometer genügt oder ob man vorher chromatographisch trennen muss.
Begriff der Selektivität
Arzneistoffe liegen fast nie allein vor. Eine Tablette enthält Hilfsstoffe, eine Wirkstoffprobe Nebenprodukte der Synthese und Abbauprodukte, eine Plasmaprobe Metaboliten. All diese Stoffe neben dem Analyten heißen Begleitsubstanzen.
Selektivität ist die Fähigkeit eines Verfahrens, den Analyten in Gegenwart von Begleitsubstanzen richtig und präzise zu bestimmen. Das Ergebnis hängt also nicht davon ab, ob Begleitsubstanzen anwesend sind.
Den Begriff Spezifität verwendet man in der Validierung meist gleichbedeutend. Streng genommen meint er den Grenzfall eines Verfahrens, das ausschließlich auf den Analyten anspricht. Am schwierigsten sind chemisch ähnliche Stoffe wie Isomere, Abbauprodukte oder Metaboliten. Stört ein solcher Stoff die Messung, ist die Selektivität betroffen.
Selektivität ist ein eigener Validierungsparameter. Die Präzision beschreibt nur, wie stark wiederholte Messungen streuen. Sie sagt nichts darüber, ob ein verwandter Stoff mitgemessen wird. Auch die Unempfindlichkeit gegen kleine Änderungen von pH-Wert oder Temperatur gehört nicht zur Selektivität, sondern zur Robustheit.
Fehlende Selektivität verschlechtert vor allem die Richtigkeit. Ein miterfasster Begleitstoff verschiebt das Ergebnis systematisch in eine Richtung. Man kann sich das wie eine Waage vorstellen, auf der unbemerkt ein kleines Gewichtsstück liegt. Jede Wägung ist reproduzierbar, aber alle sind zu hoch. Ein Verfahren kann also sehr präzise und trotzdem falsch sein.
UV-Photometrie und HPLC im Vergleich
Die direkte UV-Photometrie misst die Absorbanz der ganzen Lösung bei einer Wellenlänge. Die Absorbanzen aller absorbierenden Stoffe addieren sich: \(A_{ges} = A_{Analyt} + A_{Begleitstoff}\). Das Photometer kann nicht erkennen, welcher Anteil vom Analyten stammt. Absorbiert ein Begleitstoff bei der Messwellenlänge mit, steigt die Gesamtabsorbanz und der berechnete Gehalt fällt zu hoch aus.
Ein Zahlenbeispiel: Der Analyt allein ergäbe eine Absorbanz von 0,40. Ein Abbauprodukt mit ähnlichem Chromophor trägt 0,04 bei. Gemessen werden 0,44, der Gehalt erscheint also um 10 % zu hoch.
Die HPLC mit UV-Detektion nutzt denselben Messprinzip, schaltet aber eine Trennsäule davor. Analyt und Begleitstoffe verlassen die Säule zu verschiedenen Retentionszeiten. Der Detektor erfasst sie nacheinander als getrennte Peaks, wie das Chromatogramm rechts in der Abbildung zeigt. Ausgewertet wird nur die Fläche des Analytpeaks. Der Gewinn an Selektivität stammt also aus der chromatographischen Trennung, nicht aus einem besseren Detektor.
Besonders deutlich wird das bei Gemischen strukturähnlicher Metaboliten. Sie tragen meist denselben Chromophor und haben fast deckungsgleiche Spektren. Ohne vorherige Trennung lässt sich ein solches Gemisch UV-spektroskopisch nicht selektiv auswerten. Für Gehaltsbestimmungen neben Abbauprodukten und in der Bioanalytik wählt man deshalb bevorzugt die HPLC.
Wird im Examen gerne gefragt: Die direkte UV-Photometrie ist weniger selektiv als die HPLC-UV, weil sie mitabsorbierende Begleitstoffe miterfasst. Achte auf die Richtung des Fehlers: Die Gehaltswerte werden überhöht, nicht erniedrigt.
Photometrische Bestimmbarkeit von Arzneistoffen
Voraussetzung jeder UV-Bestimmung ist ein Chromophor. Das ist ein Molekülteil mit π-Elektronen, der im UV absorbiert. Wie Struktur und Absorption zusammenhängen, erklärt die Einheit zu Chromophoren und Bandenverschiebungen. Hier geht es um die Anwendung: Bei welcher Wellenlänge lässt sich ein Arzneistoff messen?
Ein isolierter Phenylring absorbiert schwach um 255 nm. Substituenten wie \(\ce{OH}\) oder \(\ce{NH2}\) verschieben die Bande zu längeren Wellenlängen. Daraus ergeben sich die Messbereiche in der Tabelle.
| Arzneistoff | Chromophor | Bestimmung |
|---|---|---|
| Phenol | Phenylring mit OH-Gruppe | UV bei etwa 280 nm |
| Diphenhydraminhydrochlorid | zwei isolierte Phenylringe | UV bei 258 nm |
| Methamphetaminhydrochlorid | isolierter Phenylring | UV zwischen 250 und 260 nm |
| Benazepril | aromatische Ringe | UV bei 240 nm |
| Sulfanilamid | Aminobenzol mit Sulfonamidgruppe | UV im Bereich 250 bis 350 nm |
| Modafinil | Diphenylmethylgruppe | HPLC mit UV-Detektion |
So beurteilst du die Bestimmbarkeit aus der Struktur:
- Chromophor suchen: aromatische Ringe, konjugierte Doppelbindungen, konjugierte Carbonylgruppen.
- Lage abschätzen: Ein isolierter Benzolring liegt um 255 nm, Auxochrome wie OH oder \(\ce{NH2}\) verschieben bathochrom.
- Farbe prüfen: Eine farblose Substanz hat kein Absorptionsmaximum im Sichtbaren oberhalb von etwa 400 nm.
- Probe beurteilen: Absorbieren Begleitstoffe mit, braucht man eine Trennung, also HPLC-UV.
Schritt 3 hilft bei unplausiblen Angaben. Cinnarizin besitzt kein brauchbares Maximum bei etwa 480 nm. Clonidinhydrochlorid zeigt in salzsaurer Lösung kein Maximum bei 425 nm. Beide Stoffe sind farblos und absorbieren nur im UV.
Quiz
Aussage 1
Die höhere Selektivität der HPLC-UV gegenüber der direkten UV-Photometrie beruht auf der Trennung vor der Detektion.
Analyt und Begleitstoffe erscheinen bei verschiedenen Retentionszeiten als getrennte Peaks, ausgewertet wird nur der Analytpeak.
Aussage 2
Absorbiert ein Begleitstoff bei der Messwellenlänge mit, liefert die direkte UV-Photometrie einen zu niedrigen Gehalt.
Die Absorbanzen addieren sich. Der Gehalt erscheint daher zu hoch.
Aussage 3
Ein Verfahren, dessen Wiederholmessungen kaum streuen, ist damit automatisch selektiv.
Geringe Streuung kennzeichnet die Präzision. Ob verwandte Stoffe mitgemessen werden, beschreibt allein die Selektivität.
Aussage 4
Clonidinhydrochlorid besitzt in salzsaurer Lösung ein für die Gehaltsbestimmung geeignetes Absorptionsmaximum bei 425 nm.
Clonidinhydrochlorid ist farblos und hat kein Maximum bei 425 nm, es absorbiert nur im UV.
Aussage 5
Phenol lässt sich UV-photometrisch bei etwa 280 nm quantitativ bestimmen.
Die OH-Gruppe verschiebt die Bande des Phenylrings auf etwa 280 nm.
Aussage 6
Mangelnde Selektivität eines Verfahrens wirkt sich auf die Richtigkeit des Ergebnisses aus.
Ein miterfasster Begleitstoff verschiebt das Ergebnis systematisch und verfälscht so die Richtigkeit.
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