Isotachophorese und Disk-Elektrophorese
Wie Leit- und Folgeelektrolyt in der Isotachophorese Ionen zu gleich schnellen Zonen ordnen und wie die Disk-Elektrophorese dieses Prinzip zum Stapeln von Proteinen nutzt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Isotachophorese trennt geladene Analyte nach ihrer Mobilität in einem diskontinuierlichen Elektrolytsystem aus Leit- und Folgeelektrolyt.
- Die Ionen des Leitelektrolyten sind beweglicher, die des Folgeelektrolyten weniger beweglich als alle Analyte.
- Alle Zonen wandern aneinandergrenzend gleich schnell, die Feldstärke steigt dafür stufenweise zur Folgezone hin an.
- Im Isotachopherogramm dient die Stufenhöhe zur Identifizierung, die Stufenlänge zur Gehaltsbestimmung.
- Bei der Disk-Elektrophorese stapelt eine Isotachophorese die Proteine im Sammelgel (pH 6,8, große Poren), getrennt wird im Trenngel (pH 8,8, kleine Poren) bei konstanter Feldstärke.
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Worum es geht
Die Isotachophorese ist ein elektrophoretisches Verfahren mit zwei verschiedenen Elektrolyten statt eines einheitlichen Puffers. Sie dient zur Quantifizierung geladener Analyte. Außerdem steckt sie im Sammelgel der Disk-Elektrophorese, mit der man Proteine in scharfen Banden trennt.
Prinzip der Isotachophorese
Die Isotachophorese (ITP) trennt geladene Analyte nach ihrer elektrophoretischen Mobilität. Anders als die Zonenelektrophorese arbeitet sie nicht mit einem einzigen Puffer. Sie nutzt ein diskontinuierliches Elektrolytsystem. Die Probe sitzt dabei zwischen zwei verschiedenen Elektrolyten:
- Leitelektrolyt: liegt in Wanderungsrichtung vorn. Seine Ionen sind beweglicher als alle Analyte.
- Folgeelektrolyt: liegt hinten. Seine Ionen sind weniger beweglich als alle Analyte.
- Analyte: ordnen sich dazwischen nach abnehmender Mobilität.
Nach kurzer Zeit besteht jede Zone nur noch aus einer Ionensorte. Die Zonen grenzen direkt aneinander und wandern alle mit gleicher Geschwindigkeit. Daher stammt der Name (griechisch isos gleich, tachos Geschwindigkeit). Das gelingt nur, weil die Feldstärke nicht konstant ist. Aus \(v = \mu \cdot E\) folgt: Eine Zone mit kleiner Mobilität \(\mu\) braucht eine höhere Feldstärke \(E\). Die Feldstärke steigt deshalb stufenweise von der Leit- zur Folgezone an.
Die Zonengrenzen bleiben von selbst scharf. Eilt ein Ion in die schnellere Nachbarzone voraus, gerät es dort in eine niedrigere Feldstärke. Es wird langsamer und fällt zurück. Man kann sich das wie eine Kolonne vorstellen, in der jeder seinen Platz von selbst wiederfindet.
Nicht dissoziierbare Analyte wandern im Feld nicht und lassen sich daher nicht isotachophoretisch trennen. Der Leitelektrolyt verbessert auch nicht die UV-Detektierbarkeit. Er legt Geschwindigkeit und Konzentration der Zonen fest. Leit- und Folgeelektrolyt kennzeichnen die ITP, während die isoelektrische Fokussierung mit einem pH-Gradienten arbeitet.
Das Prinzip der ITP wird im Examen gerne gefragt: Leitionen sind beweglicher, Folgeionen weniger beweglich als die Analyte. Achte darauf, dass alle Zonen gleich schnell wandern und stattdessen die Feldstärke von Zone zu Zone wechselt.
Quantitative Isotachophorese
Die ITP eignet sich zur quantitativen Analyse geladener Analyte. Der Grund liegt in der Zonenkonzentration. Sie wird vom Leitelektrolyten vorgegeben und ist für jede Ionensorte festgelegt. Mehr Stoff macht eine Zone also nicht dichter, sondern länger.
Ein Detektor, etwa für die Leitfähigkeit, zeichnet ein Isotachopherogramm auf. Es hat die Form einer Treppe. Die Stufenhöhe ist für jede Ionensorte typisch und dient der Identifizierung. Die Stufenlänge ist der Stoffmenge proportional und dient der Gehaltsbestimmung.
Da jede Zone auf eine feste Konzentration gebracht wird, konzentriert die ITP verdünnte Proben zugleich auf. Genau diesen Effekt nutzt die Disk-Elektrophorese.
Disk-Elektrophorese
Die Disk-Elektrophorese (von diskontinuierlich) trennt Proteine in einem Polyacrylamidgel aus zwei Schichten. Beide unterscheiden sich in pH-Wert, Pufferionen und Porengröße.
Oben, pH 6,8, große Poren. Hier läuft eine Isotachophorese mit Bereichen unterschiedlicher Feldstärke ab.
Unten, pH 8,8, kleine Poren. Hier herrscht eine konstante Feldstärke.
Als Elektrodenpuffer dient meist Tris-Glycin, die Gele enthalten Chlorid.
- Start: Die Probe steht als breite Zone in der Geltasche.
- Stapelung im Sammelgel: Chlorid wirkt als schnelles Leition. Glycin ist bei pH 6,8 kaum geladen und wirkt als langsames Folgeion. Die Proteine sammeln sich dazwischen zu einer schmalen Bande.
- Trennung im Trenngel: Bei pH 8,8 wird Glycin stärker negativ geladen und überholt die Proteine. Die Stapelung endet. Die Proteine trennen sich bei konstanter Feldstärke nach Ladung und Größe im Molekularsieb.
An einem Schema erkennst du die Disk-Elektrophorese an zwei Gelschichten mit verschiedenem pH und Porengröße und an der gestapelten Bande an der Gelgrenze. Wie die ITP trennt sie nur dissoziierbare, also geladene Analyte.
Quiz
Aussage 1
In der Isotachophorese sind die Ionen des Folgeelektrolyten beweglicher als die zu trennenden Analyte.
Die Folgeionen sind weniger beweglich als alle Analyte. Beweglicher als die Analyte sind die Ionen des Leitelektrolyten.
Aussage 2
Bei der Disk-Elektrophorese läuft die Isotachophorese im Trenngel ab, während im Sammelgel eine konstante Feldstärke herrscht.
Umgekehrt: Im Sammelgel stapelt eine Isotachophorese die Proteine bei unterschiedlichen Feldstärken, im Trenngel herrscht konstante Feldstärke.
Aussage 3
Im Isotachopherogramm ist die Länge einer Stufe der Stoffmenge des betreffenden Analyten proportional.
Die Zonenkonzentration ist festgelegt, mehr Stoff verlängert die Zone. Die Stufenlänge dient daher der Gehaltsbestimmung, die Stufenhöhe der Identifizierung.
Aussage 4
In der Zone des am wenigsten beweglichen Analyten herrscht bei der Isotachophorese eine höhere Feldstärke als in den Zonen beweglicherer Analyte.
Wegen \(v = \mu \cdot E\) braucht eine Zone mit kleiner Mobilität eine höhere Feldstärke, damit sie gleich schnell wandert wie die übrigen Zonen.
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