Robustheit und Auswahl von Validierungsparametern
Was Robustheit bedeutet, wie man sie prüft und welche Validierungsparameter eine Identitätsprüfung, eine Gehaltsbestimmung und eine Spurenbestimmung im Plasma brauchen.
Das Wichtigste in Kürze
- Validierungsparameter sind Leistungskenngrößen eines Analysenverfahrens. Welche man prüft, hängt von der Prüfungsart ab.
- Robustheit ist die Fähigkeit, auch bei kleinen Änderungen der Bedingungen reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Man prüft sie durch gezielte Parametervariation oder im Ringversuch und betrachtet Streuung und systematische Fehler.
- Robustheit ist nicht die Übereinstimmung bei einer Mehrfachbestimmung, das ist die Präzision. Ein präzises Verfahren ist nicht automatisch robust.
- Eine Identitätsprüfung braucht vor allem Spezifität bzw. Selektivität. Eine Gehaltsbestimmung braucht Selektivität, Richtigkeit, Präzision und Empfindlichkeit, aber keine Detektionsgrenze.
- Für Testosteron im Plasma im nanomolaren Bereich sind zusätzlich Bestimmungsgrenze, Empfindlichkeit und Selektivität gegenüber der Matrix wichtig.
Worum es geht
Ein Analysenverfahren muss nicht alles können, sondern genau das, wofür man es einsetzt. Welche Kenngrößen man belegen muss, hängt deshalb von der Fragestellung ab. Die Robustheit kommt dazu: Sie zeigt, ob die Methode auch im Alltag eines anderen Labors funktioniert.
Validierung im Überblick
Eine Validierung belegt mit Daten, dass ein Verfahren für seinen Zweck geeignet ist. Dazu prüft man einzelne Kenngrößen, die Validierungsparameter.
Ein Validierungsparameter ist eine messbare Leistungskenngröße eines Analysenverfahrens. Welche Parameter man prüft, richtet sich nach der Prüfungsart.
Die wichtigsten Parameter im Überblick:
Robustheit
Im Labor schwanken Bedingungen immer ein wenig. Der pH-Wert eines Puffers liegt mal etwas höher, die Säule ist etwas wärmer. Ein gutes Verfahren steckt das weg.
Robustheit ist die Fähigkeit eines Verfahrens, auch bei kleinen Änderungen der Bedingungen reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Das Ergebnis bleibt also weitgehend unabhängig von äußeren Einflüssen.
Geprüft wird sie durch gezielte Variation relevanter Verfahrensparameter. In der HPLC sind das etwa pH-Wert und Zusammensetzung der mobilen Phase, Säulentemperatur, Fließgeschwindigkeit oder Säulencharge. Die Umgebungstemperatur ist also nur einer von vielen Einflüssen. Man vergleicht dann, ob sich die Streuung der Ergebnisse ändert und ob systematische Fehler auftreten, also ob sich der Mittelwert verschiebt (Fehlerarten).
Die Abbildung zeigt eine wenig robuste Methode. Bei Soll-pH sind Haupt- und Nebenpeak getrennt. Schon 0,1 pH-Einheiten Abweichung lassen beide zusammenfallen. Der Gehalt fällt dann systematisch zu hoch aus.
Eine zweite Möglichkeit ist der Ringversuch. Mehrere Labore analysieren dieselbe Probe nach derselben Vorschrift. Geräte, Reagenzien und Personal unterscheiden sich dabei von selbst. Stimmen die Ergebnisse trotzdem überein, ist das Verfahren robust.
Robustheit ist nicht dasselbe wie Präzision. Präzision beschreibt die Übereinstimmung von Messwerten bei einer Mehrfachbestimmung unter gleichen Bedingungen. Eine Methode kann hochpräzise sein und trotzdem bei der kleinsten pH-Änderung versagen. Höhere Präzision macht ein Verfahren deshalb nicht robuster.
Parameter nach Prüfungsart
Welche Parameter man validiert, bestimmen drei Fragen: Geht es um Identität oder Menge? Liegt der Stoff als Hauptbestandteil oder als Spur vor? Stört eine Matrix?
| Prüfungsart | Relevante Parameter | Nicht vorrangig |
|---|---|---|
| Identitätsprüfung | Spezifität bzw. Selektivität | Nachweisgrenze, Bestimmungsbereich, Richtigkeit, Präzision |
| Gehaltsbestimmung eines Wirkstoffs | Selektivität, Richtigkeit, Präzision, Empfindlichkeit | Detektionsgrenze |
| Spur in biologischer Matrix | Selektivität, Bestimmungsgrenze, Empfindlichkeit, Richtigkeit, Präzision | – |
Eine Identitätsprüfung ist qualitativ. Sie muss nur sicher zeigen, dass der richtige Stoff vorliegt und kein ähnlicher. Richtigkeit, Präzision und Bestimmungsbereich beschreiben dagegen Mengen und gehören zu quantitativen Verfahren.
Bei der Gehaltsbestimmung liegt der Wirkstoff in hoher Konzentration vor. Ob er gerade noch nachweisbar wäre, interessiert hier nicht. Entscheidend sind ein richtiges, präzises Ergebnis und ein Signal, das genügend auf Konzentrationsänderungen anspricht.
So wählst du die Parameter für den Nachweis von Testosteronmissbrauch im Plasma aus:
- Frage: Missbrauch erkennt man an erhöhten Spiegeln. Das Verfahren ist also quantitativ, Richtigkeit und Präzision sind nötig.
- Konzentration: Testosteron liegt im nanomolaren Bereich vor. Daher braucht man eine ausreichend niedrige Bestimmungsgrenze und hohe Empfindlichkeit.
- Matrix: Plasma enthält viele ähnliche endogene Steroide. Deshalb ist die Selektivität zu belegen.
Quiz
Aussage 1
Die Robustheit eines HPLC-Verfahrens lässt sich in einem Ringversuch mehrerer Labore untersuchen.
Im Ringversuch unterscheiden sich Geräte, Reagenzien und Personal von selbst. Gleichbleibende Ergebnisse sprechen für ein robustes Verfahren.
Aussage 2
Für die Gehaltsbestimmung eines Hauptwirkstoffs in einer Tablette muss die Nachweisgrenze validiert werden.
Der Wirkstoff liegt in hoher Konzentration vor, die Detektionsgrenze ist daher nicht relevant. Wichtig sind Selektivität, Richtigkeit, Präzision und Empfindlichkeit.
Aussage 3
Je besser die Messwerte einer Mehrfachbestimmung übereinstimmen, desto robuster ist das Analysenverfahren.
Die Übereinstimmung bei Mehrfachbestimmung beschreibt die Präzision. Robustheit betrifft die Unabhängigkeit des Ergebnisses von kleinen Änderungen der Bedingungen und steigt nicht mit der Präzision.
Aussage 4
Bei der quantitativen Bestimmung von Testosteron im Blutplasma im nanomolaren Bereich sind Selektivität und Bestimmungsgrenze relevante Validierungsparameter.
Die niedrige Konzentration erfordert eine ausreichend niedrige Bestimmungsgrenze. Die Plasmamatrix mit ähnlichen Steroiden erfordert Selektivität.
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