Fluoreszenzmarkierung durch Derivatisierung
Wie man nicht fluoreszierende Analyten durch kovalentes Anhängen eines Fluorophors fluorimetrisch nachweisbar macht und passende Reagenzien für Amine und Säurechloride erkennt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Fluoreszenzmarkierung ist eine Derivatisierung, bei der ein Fluorophor kovalent an einen nicht fluoreszierenden Analyten gebunden wird, meist zur Detektion in der Chromatographie.
- Ein Marker braucht einen Fluorophor und eine zum Analyten komplementäre reaktive Gruppe: elektrophil für Amine, nucleophil für Säurechloride.
- o-Phthalaldehyd bildet mit Thiol bei pH 9,5 aus primären Aminogruppen fluoreszierende Isoindole; in Proteinen reagieren N-Terminus und Lysin, Peptidbindungen und der Indolring von Tryptophan nicht.
- Dansylchlorid (\(\ce{-SO2Cl}\)), FITC (\(\ce{-N=C=S}\)) und 4-Brommethyl-7-dimethylaminocumarin (\(\ce{-CH2Br}\)) markieren primäre Amine; Anthracen und Fluorescein ohne reaktive Gruppe sind ungeeignet.
- Dansylhydrazin markiert Carbonsäurechloride über seine nucleophile Hydrazingruppe; 6-Methoxychinolin fehlt die reaktive Gruppe, 4-Nitroanilin und 4-Nitrobenzoylchlorid fehlt der Fluorophor.
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Worum es geht
Viele Arzneistoffe, Aminosäuren und Peptide fluoreszieren nicht von selbst. Man kann sie aber chemisch mit einer leuchtenden Molekülgruppe verknüpfen und dann empfindlich fluorimetrisch bestimmen. Dieses Vorgehen ist die Grundlage der Fluoreszenzdetektion vieler Analyten in der Chromatographie.
Prinzip der Fluoreszenzmarkierung
Ein Analyt ohne eigenen Fluorophor liefert im Fluorimeter kein Signal. Man setzt ihn deshalb vor der Messung mit einem Reagenz um, das einen Fluorophor mitbringt.
Derivatisierung ist die gezielte chemische Umsetzung eines Analyten zu einem Derivat mit besser nachweisbaren Eigenschaften. Bei der Fluoreszenzmarkierung wird dabei ein Fluorophor kovalent an den Analyten gebunden.
Ein Fluoreszenzmarker besteht aus zwei Bausteinen. Der Fluorophor sorgt für das Leuchten. Die reaktive Gruppe knüpft die kovalente Bindung zum Analyten. Sie muss zur funktionellen Gruppe des Analyten passen wie ein Stecker zur Steckdose: Ein nucleophiler Analyt wie ein Amin braucht einen elektrophilen Marker. Ein elektrophiler Analyt wie ein Säurechlorid braucht einen nucleophilen Marker.
Ein Reagenz taugt nur dann als Fluoreszenzmarker, wenn es beides besitzt: einen Fluorophor und eine zum Analyten komplementäre reaktive Gruppe. Fehlt eines von beiden, ist es ungeeignet.
Genutzt wird das vor allem zur Detektion in der Chromatographie, etwa mit dem Fluoreszenzdetektor der HPLC oder bei der Detektion in der DC.
o-Phthalaldehyd
o-Phthalaldehyd (OPA) ist das Standardreagenz für primäre Aminogruppen. Es reagiert nur zusammen mit einem Thiol, etwa 2-Mercaptoethanol, und im schwach alkalischen Milieu bei pH 9,5. Dort liegt die Aminogruppe unprotoniert und damit nucleophil vor. Es entsteht ein fluoreszierendes Isoindol-Derivat, genauer ein 1-Alkylthio-2-alkylisoindol.
\[\ce{C6H4(CHO)2 + R-NH2 + R'SH -> }\text{1-Alkylthio-2-alkylisoindol}\ce{ + 2 H2O}\]
Der Stickstoff des Amins wird dabei Teil des neuen Fünfrings. Deshalb braucht er zwei Wasserstoffatome, die er mit den beiden Aldehydsauerstoffen als Wasser abgibt.
In Proteinen und Peptiden reagieren daher die N-terminale Aminogruppe und die primären Aminogruppen der Lysin-Seitenketten. Die Carboxamidgruppen der Peptidbindungen reagieren nicht, denn ihr Stickstoff ist durch die Carbonylgruppe kaum nucleophil. Auch der Indolring von Tryptophan reagiert nicht. Sein NH ist Teil eines aromatischen Rings und keine primäre Aminogruppe.
Marker für primäre Amine
Neben OPA gibt es Marker, die Fluorophor und elektrophile Gruppe in einem Molekül vereinen. Die Aminogruppe greift jeweils die elektrophile Gruppe an.
| Reagenz | Fluorophor | aminreaktive Gruppe | Produkt mit \(\ce{R-NH2}\) |
|---|---|---|---|
| Dansylchlorid | Dimethylaminonaphthalin | Sulfonylchlorid \(\ce{-SO2Cl}\) | Sulfonamid |
| Fluoresceinisothiocyanat (FITC) | Fluorescein | Isothiocyanat \(\ce{-N=C=S}\) | Thioharnstoff |
| 4-Brommethyl-7-dimethylaminocumarin | Aminocumarin | Brommethyl \(\ce{-CH2Br}\) | sekundäres Amin |
An einer Strukturformel prüfst du also zuerst das ausgedehnte aromatische System und dann die elektrophile Gruppe. Anthracen und Fluorescein fluoreszieren zwar stark. Ihnen fehlt aber eine aminreaktive Gruppe, sodass sie nicht kovalent binden. Erst die Isothiocyanatgruppe macht aus Fluorescein den Marker FITC. Deuteriumoxid tauscht nur Protonen gegen Deuterium aus und bringt keinen Fluorophor mit.
Marker für Carbonsäurechloride
Carbonsäurechloride sind Elektrophile. Ein Marker für sie braucht daher neben dem Fluorophor eine nucleophile Gruppe. Dansylhydrazin erfüllt beides: Das Dansylsystem fluoresziert, und die Hydrazingruppe \(\ce{-NH-NH2}\) greift das Carbonyl-C an. Es entsteht ein fluoreszierendes Säurehydrazid.
Bei anderen Kandidaten fehlt jeweils ein Baustein:
| Reagenz | Fluorophor | Nucleophil | geeignet |
|---|---|---|---|
| Dansylhydrazin | ja | ja, Hydrazin | ja |
| 6-Methoxychinolin | ja | keine reaktive Gruppe | nein |
| 4-Nitroanilin | nein, Nitrogruppe löscht | ja, \(\ce{-NH2}\) | nein |
| 4-Nitrobenzoylchlorid | nein | selbst ein Elektrophil | nein |
4-Nitrobenzoylchlorid ist selbst ein Säurechlorid und kann mit einem anderen Säurechlorid nicht reagieren. Die Nitrogruppe unterdrückt zudem die Fluoreszenz, wie bei 4-Nitroanilin. 6-Methoxychinolin leuchtet, bindet aber nicht kovalent.
Quiz
Aussage 1
Für die Umsetzung primärer Amine mit o-Phthalaldehyd werden ein Thiol und ein schwach alkalischer pH-Wert um 9,5 benötigt.
Das Thiol wird in das Isoindol eingebaut, und bei pH 9,5 liegt die Aminogruppe unprotoniert und nucleophil vor.
Aussage 2
Dansylhydrazin eignet sich zur Fluoreszenzmarkierung von Carbonsäurechloriden, weil es einen Fluorophor und eine nucleophile Hydrazingruppe besitzt.
Die Hydrazingruppe greift das elektrophile Carbonyl-C an, das Dansylsystem liefert die Fluoreszenz.
Aussage 3
o-Phthalaldehyd setzt den Indolring von Tryptophan zu einem fluoreszierenden Isoindol um.
Das Indol-NH ist Teil eines aromatischen Rings und keine primäre Aminogruppe. OPA reagiert nur mit primären Aminogruppen wie N-Terminus und Lysin-Seitenketten.
Aussage 4
Fluorescein ohne weitere funktionelle Gruppe eignet sich wegen seiner starken Fluoreszenz zur Derivatisierung primärer Amine.
Fluorescein fehlt eine aminreaktive Gruppe. Erst mit der Isothiocyanatgruppe (FITC) bindet es kovalent an Amine.
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