Chromatogramm, Retentionszeiten und Rf-Wert
Wie ein Chromatogramm aufgebaut ist, welche Strecken Gesamtretentionszeit, Totzeit und Nettoretentionszeit bedeuten und wie der Rf-Wert der Dünnschichtchromatographie definiert ist.
Das Wichtigste in Kürze
- Ein Chromatogramm trägt das Detektorsignal gegen die Zeit auf; aus Peakmaxima, Peakhöhe, Halbwertsbreite (Breite bei \(h/2\)) und Basisbreite liest man die Kenngrößen ab.
- Die Gesamtretentionszeit \(t_R\) reicht vom Einspritzen bis zum Peakmaximum und ist die Summe der Aufenthaltszeiten in mobiler und stationärer Phase.
- Die Totzeit \(t_M\) ist die Retentionszeit einer nicht zurückgehaltenen Komponente und entspricht der Aufenthaltszeit in der mobilen Phase; in der GC dienen Luft oder Methan als Totzeitmarker.
- Die Nettoretentionszeit \(t_R' = t_R - t_M\) entspricht der Aufenthaltszeit in der stationären Phase und ist die Strecke vom Luftpeak bis zum Substanzpeak.
- Der Rf-Wert ist der Quotient aus Strecke Start bis Fleckmitte und Strecke Start bis Front; er ist dimensionslos, liegt zwischen 0 und 1 und ist zwischen 0,2 und 0,8 günstig.
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Worum es geht
Jede chromatographische Trennung endet mit einem Bild: Peaks in der Säulenchromatographie, Flecken in der Dünnschichtchromatographie. Aus Zeiten und Strecken in diesem Bild leitet man ab, wie stark eine Substanz zurückgehalten wird. Das ist die Grundlage für die Identitätsprüfung von Arzneistoffen und für alle weiteren Kenngrößen wie Retentionsfaktor oder Auflösung.
Aufbau eines Chromatogramms
Ein Chromatogramm zeigt das Signal des Detektors auf der y-Achse und die Zeit auf der x-Achse. Der Nullpunkt ist der Moment des Einspritzens. Wie die Trennung selbst zustande kommt, erklärt die Einheit Chromatographische Trennprinzipien.
Verlässt eine Substanz die Säule, steigt das Signal an und fällt wieder ab. So entsteht ein Peak, im Idealfall in Form einer Gauß-Kurve. Die Peakhöhe \(h\) misst man von der Basislinie bis zum Maximum. Die Halbwertsbreite \(w_h\) ist die Breite des Peaks auf halber Höhe, also bei \(h/2\). Die Basisbreite \(w_b\) ergibt sich aus den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der Basislinie.
Im Gaschromatogramm erscheint vor dem Substanzpeak oft ein kleiner Luftpeak. Er markiert die Totzeit. Die Abbildung zeigt alle Strecken in einem Schema.
Wer die Strecken sicher zuordnen will, achtet auf zwei Fragen: Liegt die Strecke auf der Zeitachse oder am Peak selbst? Und wo beginnt sie?
| Größe | Symbol | Strecke im Chromatogramm |
|---|---|---|
| Totzeit | \(t_M\) | Einspritzen bis Maximum des Luftpeaks |
| Gesamtretentionszeit | \(t_R\) | Einspritzen bis Maximum des Substanzpeaks |
| Nettoretentionszeit | \(t_R'\) | Maximum Luftpeak bis Maximum Substanzpeak |
| Peakhöhe | \(h\) | Basislinie bis Peakmaximum, senkrecht |
| Halbwertsbreite | \(w_h\) | Peakbreite bei \(h/2\) |
| Basisbreite | \(w_b\) | Abstand der Wendetangenten auf der Basislinie |
Gesamtretentionszeit
Die Gesamtretentionszeit \(t_R\) reicht vom Einspritzen bis zum Peakmaximum der Substanz. Man nennt sie auch Bruttoretentionszeit. Sie umfasst die ganze Reise durch die Säule.
Während dieser Reise pendelt die Substanz zwischen den Phasen. Ein Teil der Zeit wird sie von der mobilen Phase mitgetragen. Den Rest verbringt sie gebunden an der stationären Phase. Die Gesamtretentionszeit ist deshalb die Summe beider Aufenthaltszeiten.
Wie lange eine Substanz an der stationären Phase bleibt, hängt von ihrem Verteilungskoeffizienten zwischen den Phasen ab. Je stärker sie die stationäre Phase bevorzugt, desto länger ist \(t_R\).
Multipliziert man \(t_R\) mit der Flussrate \(F\) der mobilen Phase, erhält man das Retentionsvolumen \(V_R = t_R \cdot F\). Es gibt an, wie viel mobile Phase bis zum Peakmaximum durch die Säule geflossen ist. Bei \(t_R = 5{,}0\) min und \(F = 1{,}5\) mL/min beträgt \(V_R\) also 7,5 mL.
Totzeit
Eine Substanz, die mit der stationären Phase gar nicht wechselwirkt, wandert so schnell wie die mobile Phase. Ihre Retentionszeit heißt Totzeit \(t_M\), englisch Hold-up-Zeit. Sie entspricht der Zeit, die jede Substanz mindestens in der mobilen Phase verbringt.
Man liest die Totzeit am Signal einer solchen nicht zurückgehaltenen Komponente ab. Diese Komponente heißt Totzeitmarker. In der Gaschromatographie dient dazu meist Luft: Die Totzeit ist die Strecke vom Start bis zum Luftpeak. Alternativ lässt sich \(t_M\) über die Retentionszeit von Methan abschätzen, das auf üblichen GC-Säulen kaum zurückgehalten wird.
Auch hier führt die Flussrate zum Volumen. Das Totvolumen \(V_M = t_M \cdot F\) ist das Volumen an mobiler Phase in Säule und Leitungen.
Die Zuordnung der Totzeit zur mobilen Phase wird im Examen gerne gefragt: Sie ist die Retentionszeit einer nicht retinierten Komponente wie Luft oder Methan und gleich der Aufenthaltszeit in der mobilen Phase.
Nettoretentionszeit
Zieht man von der Gesamtretentionszeit die Totzeit ab, bleibt nur die Zeit übrig, in der die Substanz tatsächlich festgehalten wurde. Das ist die Nettoretentionszeit \(t_R'\), auch adjustierte Retentionszeit genannt.
\[t_R' = t_R - t_M\]
\(t_R'\) Nettoretentionszeit, \(t_R\) Gesamtretentionszeit, \(t_M\) Totzeit, jeweils in min oder s.
Umgestellt ergibt sich \(t_M = t_R - t_R'\). Alle Substanzen verbringen dieselbe Zeit \(t_M\) in der mobilen Phase. Unterschiede in der Retention entstehen deshalb allein in der stationären Phase. Die Nettoretentionszeit entspricht genau dieser Aufenthaltszeit in der stationären Phase.
Man kann sich die Säule wie eine Straße mit Raststätten vorstellen. Alle Autos fahren gleich schnell, die Fahrzeit ist die Totzeit. Wer länger rastet, kommt später an, und die Rastzeit ist die Nettoretentionszeit.
Im Chromatogramm ist \(t_R'\) die Strecke vom Luftpeak bis zum Substanzpeak. Ein Rechenbeispiel: Der Luftpeak erscheint bei 1,2 min, der Substanzpeak bei 5,0 min. Dann ist \(t_R' = 5{,}0 - 1{,}2 = 3{,}8\) min. Die Peakbreite spielt dafür keine Rolle, denn alle Zeiten beziehen sich auf die Peakmaxima.
In älteren Lehrbüchern stehen andere Symbole: \(t_d\) für die Totzeit, \(t_{dr}\) für die Gesamt- und \(t_r\) für die Nettoretentionszeit. Die Beziehung \(t_r = t_{dr} - t_d\) ist dieselbe.
Die Nettoretentionszeit \(t_R' = t_R - t_M\) ist die Aufenthaltszeit in der stationären Phase, die Totzeit die in der mobilen Phase. Diese Zuordnung solltest du sicher können, ebenso die Strecke vom Luftpeak bis zum Substanzmaximum im Schema.
Aus \(t_R'\) und \(t_M\) berechnet man später den Retentionsfaktor.
Rf-Wert
In der Dünnschichtchromatographie misst man keine Zeiten, sondern Strecken. Alle Substanzen laufen gleich lange, bis man die Platte herausnimmt. Die Kenngröße dafür ist der Rf-Wert, auch \(R_F\) geschrieben.
Der Rf-Wert ist der Quotient zweier Laufstrecken. Im Zähler steht die Strecke der Substanz vom Start bis zur Fleckmitte. Im Nenner steht die Strecke des Fließmittels vom Start bis zur Front.
\[R_f = \frac{a}{b} = \frac{\text{Start bis Fleckmitte}}{\text{Start bis Front}}\]
Beide Strecken haben dieselbe Einheit. Der Rf-Wert ist daher dimensionslos und liegt zwischen 0 und 1. Bei 0 bleibt die Substanz am Start, bei 1 wandert sie mit der Front. Ein Beispiel: Fleckmitte bei 3,6 cm, Front bei 8,0 cm, also \(R_f = 0{,}45\). Für eine gute Auswertung sind Werte zwischen 0,2 und 0,8 günstig, denn dort liegen die Flecken gut getrennt von Start und Front.
Der Nenner ist die tatsächliche Laufstrecke der Fließmittelfront, nicht die Gesamtlänge der Sorptionsschicht. Die Front muss man deshalb direkt nach der Entwicklung markieren.
Der Rf-Wert liefert ähnliche Information wie die Retentionszeit in der HPLC: Beide beschreiben, wie stark eine Substanz unter festen Bedingungen zurückgehalten wird. Eine stark retinierte Substanz hat einen kleinen Rf-Wert, aber eine lange Retentionszeit. Wie man eine DC durchführt und auswertet, steht unter Detektion und quantitative Auswertung.
Quiz
Aussage 1
Die Totzeit entspricht der Zeit, die eine Substanz in der mobilen Phase verbringt.
Jede Substanz verbringt die Totzeit \(t_M\) in der mobilen Phase; eine nicht retinierte Komponente erscheint genau nach \(t_M\).
Aussage 2
Für die Auswertung eines Dünnschichtchromatogramms sind Rf-Werte zwischen 0,2 und 0,8 günstig.
In diesem Bereich liegen die Flecken ausreichend weit von Startlinie und Front entfernt.
Aussage 3
Ein breiterer Peak führt bei gleicher Lage des Maximums zu einer größeren Nettoretentionszeit.
Die Nettoretentionszeit bezieht sich auf die Peakmaxima und hängt nicht von der Peakbreite ab.
Aussage 4
Die Gesamtretentionszeit wird vom Einspritzen bis zum Ende des Substanzpeaks gemessen.
Gemessen wird vom Einspritzen bis zum Peakmaximum der Substanz.
Aussage 5
Die Halbwertsbreite eines Peaks wird auf halber Peakhöhe gemessen.
Die Halbwertsbreite \(w_h\) ist die Peakbreite bei \(h/2\).
Aussage 6
Die Nettoretentionszeit gibt an, wie lange sich eine Substanz in der mobilen Phase aufhält.
Die Nettoretentionszeit \(t_R' = t_R - t_M\) entspricht der Aufenthaltszeit in der stationären Phase.
Aussage 7
In der Gaschromatographie lässt sich die Totzeit über die Retentionszeit von Methan abschätzen.
Methan wird auf üblichen GC-Säulen kaum zurückgehalten und dient wie Luft als Totzeitmarker.
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