Stokes-Verschiebung und Abklingverhalten der Emission
Warum Fluoreszenzlicht stets langwelliger ist als das Anregungslicht und wie sich Fluoreszenz und Phosphoreszenz über Abklingdauer und Emissionswellenlänge unterscheiden.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Stokes-Verschiebung ist der Abstand zwischen Absorptions- und Fluoreszenzmaximum; sie entsteht durch Schwingungsrelaxation im angeregten Zustand und im Grundzustand.
- Fluoreszenzlicht ist langwelliger, energieärmer und niederfrequenter als das Anregungslicht, nach \(E = h\cdot c/\lambda\).
- Die Fluoreszenzwellenlänge ist stets größer oder gleich der Anregungswellenlänge; gleich nur beim 0-0-Übergang, und Emission im UV ist möglich.
- Die Fluoreszenzlebensdauer \(\tau\) liegt im Nanosekundenbereich; Fluoreszenz erlischt praktisch sofort mit dem Ende der Anregung.
- Fluoreszenz und Phosphoreszenz unterscheidet man über Abklingverhalten und Emissionswellenlänge; nach steigender Wellenlänge gilt Absorption < Fluoreszenz < Phosphoreszenz.
- Absorptionsmaximum und Absorptionskoeffizient taugen nicht zur Unterscheidung, weil beide Emissionen auf dieselbe Absorption zurückgehen.
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Worum es geht
Ein fluoreszierender Stoff gibt Licht ab, das energieärmer ist als das absorbierte, und hört damit fast sofort auf, wenn die Lampe ausgeht. Beide Beobachtungen folgen direkt aus dem Jablonski-Diagramm. In der Fluorimetrie bestimmen sie, welche Wellenlängen man für Anregung und Messung wählt und wie man Fluoreszenz von Phosphoreszenz trennt.
Stokes-Verschiebung
Ein fluoreszierendes Molekül nimmt ein Photon auf und gibt kurz darauf wieder eines ab. Das abgegebene Photon ist dabei nie energiereicher als das aufgenommene. Den Grund liefert das Jablonski-Diagramm.
Ursache: Schwingungsrelaxation
Die Absorption hebt das Molekül aus dem Grundzustand \(S_0\) meist in ein höheres Schwingungsniveau von \(S_1\). Von dort fällt es durch Schwingungsrelaxation strahlungslos in das unterste Schwingungsniveau von \(S_1\). Die Differenz geht als Wärme an die Umgebung, etwa an Lösungsmittelmoleküle. Erst dann folgt die Emission.
Die Emission endet oft in einem angeregten Schwingungsniveau von \(S_0\). Auch dieses relaxiert wieder strahlungslos. Energie geht also vor und nach der Emission verloren. Man kann sich das wie einen Geldumtausch hin und zurück vorstellen: Bei jedem Schritt bleibt eine Gebühr hängen, und am Ende erhält man weniger, als man eingezahlt hat.
Energie, Frequenz und Wellenlänge
Die Energie eines Photons hängt so von Frequenz und Wellenlänge ab:
\[E = h\cdot\nu = \frac{h\cdot c}{\lambda}\]
Dabei ist \(E\) die Photonenenergie in J, \(h = 6{,}626\cdot10^{-34}\) J·s die Planck-Konstante, \(\nu\) die Frequenz in Hz, \(c = 3{,}00\cdot10^{8}\) m/s die Lichtgeschwindigkeit und \(\lambda\) die Wellenlänge in m. Weniger Energie bedeutet niedrigere Frequenz und größere Wellenlänge. Das Fluoreszenzlicht ist deshalb energieärmer, niederfrequenter und langwelliger als das Anregungslicht. Bei der Absorption nimmt das Molekül also mehr Energie auf, als es bei der Emission abstrahlt.
Die Stokes-Verschiebung ist der Abstand zwischen Absorptions- und Fluoreszenzmaximum. Sie entsteht, weil das angeregte Molekül durch Schwingungsrelaxation Energie verliert, bevor und nachdem es emittiert.
Ein Beispiel mit echten Werten: Chinin in verdünnter Schwefelsäure wird bei etwa 350 nm angeregt und fluoresziert um 450 nm. Ein Photon bei 350 nm trägt rund \(5{,}7\cdot10^{-19}\) J, eines bei 450 nm nur etwa \(4{,}4\cdot10^{-19}\) J. Gut \(1{,}3\cdot10^{-19}\) J je Photon bleiben als Wärme zurück. Die Frequenz sinkt entsprechend von \(8{,}6\cdot10^{14}\) Hz auf \(6{,}7\cdot10^{14}\) Hz.
Bathochrome Lage und Grenzfall
Im Spektrum liegt das Fluoreszenzmaximum gegenüber dem Absorptionsmaximum bei größeren Wellenlängen, ist also bathochrom verschoben. Organische Fluorophore emittieren daher bei einer anderen Wellenlänge, als sie absorbieren. Nur der 0-0-Übergang zwischen den jeweils untersten Schwingungsniveaus kann in Absorption und Emission gleich liegen. Dort überlappen die Banden ein wenig. Streng gilt deshalb: Die Fluoreszenzwellenlänge ist größer oder gleich der Anregungswellenlänge, kürzer ist sie nie.
Diese Wellenlängendifferenz heißt Stokes-Verschiebung. Mit Quenching hat sie nichts zu tun, denn Quenching bezeichnet die Löschung der Fluoreszenz, also eine Abnahme der Intensität. Langwelliger heißt außerdem nicht automatisch sichtbar. Tryptophan in Proteinen wird bei etwa 280 nm angeregt und fluoresziert um 350 nm, also noch im UV-Bereich.
Wellenlängenpaare prüfen
Ob ein Paar aus Anregungs- und Emissionswellenlänge stimmen kann, prüfst du mit einem Blick: Die Emissionswellenlänge muss größer sein. Anregung bei 360 nm mit Emission bei 440 nm ist plausibel. Anregung bei 470 nm mit Emission bei 410 nm ist unmöglich, denn das emittierte Photon wäre energiereicher als das absorbierte. Konkrete Messpaare aus Arzneibuchprüfungen findest du bei der fluorimetrischen Gehaltsbestimmung.
Die Stokes-Verschiebung ist ein Examensklassiker: Fluoreszenzlicht ist wegen der Schwingungsrelaxation langwelliger, energieärmer und niederfrequenter als das Anregungslicht. Achte bei Wellenlängenpaaren darauf, dass die Emission nie kürzerwellig als die Anregung sein darf.
Lebensdauer der Fluoreszenz
Fluoreszenz ist ein schneller Prozess. Der Übergang von \(S_1\) nach \(S_0\) ist spinerlaubt, weil sich die Spinrichtung des Elektrons nicht ändert. Das Molekül verweilt deshalb nur kurz im angeregten Zustand. Endet die Anregung, erlischt die Fluoreszenz praktisch sofort. Ein Nachleuchten über Millisekunden oder gar Sekunden gibt es nicht.
Die Fluoreszenzlebensdauer \(\tau\) ist die mittlere Verweildauer eines Moleküls im angeregten Zustand \(S_1\). Nach der Zeit \(\tau\) ist die Intensität auf \(1/e\), also etwa 37 % des Anfangswerts gefallen. Typisch sind wenige Nanosekunden.
Das Abklingen folgt einer Exponentialfunktion:
\[I(t) = I_0\cdot e^{-t/\tau}\]
Hier ist \(I_0\) die Intensität im Moment des Abschaltens, \(I(t)\) die Intensität nach der Zeit \(t\) in s und \(\tau\) die Lebensdauer in s. Bei \(\tau = 5\) ns ist nach 25 ns, also nach \(5\tau\), nur noch \(e^{-5}\) übrig. Das sind etwa 0,7 % der Anfangsintensität.
Lebensdauern im Vergleich
Angeregte Zustände haben sehr unterschiedliche Lebensdauern. Die Elektronen verweilen also nicht in allen Energieniveaus gleich lange. Entscheidend ist, ob ein Übergang erlaubt oder verboten ist.
| Prozess | Typische Zeitskala |
|---|---|
| Absorption | etwa \(10^{-15}\) s |
| Schwingungsrelaxation | etwa \(10^{-12}\) s |
| Fluoreszenz (\(S_1 \to S_0\)) | \(10^{-9}\) bis \(10^{-7}\) s |
| Phosphoreszenz (\(T_1 \to S_0\)) | \(10^{-3}\) s bis Sekunden und länger |
Die Schwingungsrelaxation ist viel schneller als die Fluoreszenz. Deshalb ist das Molekül längst im untersten Schwingungsniveau von \(S_1\), bevor es emittiert. Der Triplettzustand \(T_1\) lebt dagegen lange, weil sein Übergang nach \(S_0\) eine Spinumkehr verlangt und damit spinverboten ist. Fluoreszenz klingt daher wesentlich schneller ab als Phosphoreszenz.
Fluoreszenz versus Phosphoreszenz
Fluoreszenz und Phosphoreszenz beginnen mit derselben Absorption \(S_0 \to S_1\). Bei der Phosphoreszenz wechselt das Molekül zusätzlich durch Intersystem Crossing in den Triplettzustand \(T_1\) und strahlt erst von dort ab. Zwei Eigenschaften der Emission trennen die beiden Vorgänge: das Abklingverhalten und die Lage des Emissionsmaximums.
- Übergang \(S_1 \to S_0\), spinerlaubt
- Lebensdauer im Nanosekundenbereich
- erlischt mit dem Ende der Anregung
- kürzerwellig als die Phosphoreszenz
- Übergang \(T_1 \to S_0\), spinverboten
- Lebensdauer Millisekunden bis Sekunden
- leuchtet nach Anregungsende nach
- langwelligste der drei Banden
Die Phosphoreszenz liegt noch langwelliger als die Fluoreszenz, weil \(T_1\) energetisch unter \(S_1\) liegt. Beim Intersystem Crossing und der anschließenden Relaxation geht weitere Energie verloren. Mit jedem strahlungslosen Zwischenschritt rückt die Bande also ein Stück zu größeren Wellenlängen.
Nach steigender Wellenlänge gilt: Absorption < Fluoreszenz < Phosphoreszenz. Je mehr Umwege das Molekül vor der Emission nimmt, desto langwelliger wird das Licht.
Ungeeignete Kriterien
Anders als die Emission verrät die Absorption nichts über den späteren Weg des Moleküls. Die Lage des Absorptionsmaximums und die Größe des Absorptionskoeffizienten sind für beide Emissionen dieselben, denn beide gehen auf denselben Absorptionsübergang zurück. Diese Größen bestimmen, wie stark ein Stoff leuchtet, wie die Grundgleichung der Fluoreszenzintensität zeigt. Welche Art von Emission vorliegt, entscheiden sie nicht.
Praktisch nutzt man den Zeitunterschied. Misst man erst einige Millisekunden nach einem kurzen Anregungsblitz, ist die Fluoreszenz längst abgeklungen. Das Gerät erfasst dann nur noch die Phosphoreszenz.
Quiz
Aussage 1
Der Triplettzustand \(T_1\) hat eine deutlich längere Lebensdauer als der Singulettzustand \(S_1\), weil sein Übergang nach \(S_0\) spinverboten ist.
Der Übergang \(T_1 \to S_0\) verlangt eine Spinumkehr. Deshalb lebt \(T_1\) Millisekunden bis Sekunden, \(S_1\) nur Nanosekunden.
Aussage 2
Ordnet man die Banden eines Stoffs nach steigender Wellenlänge, folgt auf die Absorption zuerst die Fluoreszenz und dann die Phosphoreszenz.
Mit jedem strahlungslosen Zwischenschritt verliert das Molekül Energie. Daher gilt Absorption < Fluoreszenz < Phosphoreszenz.
Aussage 3
Fluoreszenzstrahlung hat eine höhere Frequenz als die Strahlung, mit der der Stoff angeregt wurde.
Durch Schwingungsrelaxation verliert das Molekül Energie. Das Fluoreszenzlicht ist daher energieärmer und hat eine niedrigere Frequenz als das Anregungslicht.
Aussage 4
Den Abstand zwischen Absorptions- und Fluoreszenzmaximum bezeichnet man als Quenching.
Dieser Abstand heißt Stokes-Verschiebung. Quenching ist die Löschung der Fluoreszenz, also eine Abnahme der Intensität.
Aussage 5
Nach dem Abschalten der Anregungslampe lässt sich Fluoreszenz noch einige Sekunden lang nachweisen.
Die Fluoreszenzlebensdauer liegt im Nanosekundenbereich. Fluoreszenz erlischt praktisch sofort mit dem Ende der Anregung. Sekundenlanges Nachleuchten zeigt nur die Phosphoreszenz.
Aussage 6
Ein Fluorophor, der bei 300 nm angeregt wird und bei 380 nm emittiert, verhält sich physikalisch plausibel.
Die Emissionswellenlänge ist größer als die Anregungswellenlänge, wie es die Stokes-Verschiebung verlangt.
Aussage 7
Aus der Lage des Absorptionsmaximums kann man ablesen, ob ein Stoff fluoresziert oder phosphoresziert.
Beide Emissionen gehen auf dieselbe Absorption \(S_0 \to S_1\) zurück. Unterscheiden lassen sie sich über Abklingverhalten und Lage des Emissionsmaximums.
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