Mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
Wie Mizellen aus ionischen Tensiden in der Kapillarelektrophorese als bewegliche Phase wirken und so auch Neutralstoffe nach ihrer Lipophilie trennen.
Das Wichtigste in Kürze
- Die MEKC ist ein elektrophoretisches Verfahren der elektrokinetischen Chromatographie: Ein ionisches Tensid wie SDS bildet oberhalb der Mizellbildungskonzentration geladene Mizellen als pseudostationäre Phase.
- Gearbeitet wird wie in der Kapillarelektrophorese mit hohen Spannungen im Kilovoltbereich; auch gemischte Mizellen aus ionischen und nichtionischen Tensiden sind geeignet.
- Anionische SDS-Mizellen wandern elektrophoretisch gegen den EOF zur Anode, werden aber vom stärkeren EOF zur Kathode getragen; Neutralstoffe erscheinen zwischen \(t_0\) und \(t_{mc}\).
- Neutralstoffe trennen sich nach dem Verteilungskoeffizienten zwischen Mizelle und Puffer: je lipophiler, desto später, etwa bei Vitamin-D-Analoga in der Reihe unsubstituiert < Methyl < Ethyl < n-Butyl an C24.
- Geladene Analyte wandern außerhalb der Mizellen nach ihrer elektrophoretischen Mobilität; CE mit Cyclodextrin oder reinem Boratpuffer ohne Tensid ist keine MEKC.
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Worum es geht
Die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC) erweitert die Kapillarelektrophorese um ein chromatographisches Trennprinzip. Damit lassen sich auch ungeladene Arzneistoffe und Hilfsstoffe trennen, etwa Parabene als Konservierungsmittel oder Vitamin-D-Analoga.
Elektrokinetische Chromatographie
In der Kapillarzonenelektrophorese trennt allein die elektrophoretische Mobilität. Neutralstoffe haben keine Ladung und damit keine eigene Mobilität. Sie wandern alle gemeinsam mit dem elektroosmotischen Fluss und erscheinen als ein einziger Peak.
Die elektrokinetische Chromatographie (EKC) löst dieses Problem. Sie setzt dem Puffer eine zweite Phase zu, die sich im elektrischen Feld anders bewegt als die wässrige Lösung. Die Analyte verteilen sich zwischen beiden Phasen. So kommt zur Elektrophorese ein chromatographisches Prinzip hinzu, die Verteilung.
Eine im Trennpuffer verteilte Phase, die Analyte aufnimmt wie eine stationäre Phase, sich aber selbst durch die Kapillare bewegt. Sie ist weder fest gepackt noch an die Wand gebunden, deshalb „pseudo“.
Die wichtigste Form der EKC ist die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC). Trotz des Wortes Chromatographie ist sie ein elektrophoretisches Verfahren und kein HPLC-Verfahren. Es gibt keine Pumpe und keine gepackte Säule. Antrieb ist allein das elektrische Feld in der Kapillare.
Tensidzusatz und Mizellen
Kennzeichen der MEKC ist ein ionisches Tensid im Puffer. Der Standard ist Natriumdodecylsulfat (SDS, \(\ce{C12H25OSO3^- Na+}\)), das du schon als anionisches Tensid aus der SDS-PAGE kennst. Ein Tensidmolekül hat einen lipophilen Schwanz und eine polare Kopfgruppe.
In geringer Konzentration liegen Tenside als Einzelmoleküle vor. Oberhalb der Mizellbildungskonzentration (kritische Mizellbildungskonzentration, CMC) lagern sie sich spontan zu Mizellen zusammen. Die Alkylketten zeigen nach innen und bilden einen lipophilen Kern. Die geladenen Kopfgruppen liegen außen und halten die Mizelle in Lösung. Mehr zu Tensiden und zur CMC steht bei der Tensidtitration.
Bei SDS tragen die Mizellen außen Sulfatgruppen und sind daher negativ geladen. Man kann sich jede Mizelle wie ein winziges Öltröpfchen mit geladener Hülle vorstellen. Ein Neutralstoff kann in den Kern hinein und wieder heraus, wie die Abbildung zeigt. Die Mizellen bilden so die pseudostationäre Phase neben der wässrigen Phase.
Es gehört zum Pflichtprogramm, die MEKC als elektrophoretisches Verfahren mit ionischem Tensid oberhalb der CMC und daher geladenen Mizellen zu beschreiben. Unterhalb der CMC entsteht keine pseudostationäre Phase. Das Tensid muss aber nicht allein ionisch sein. Auch gemischte Mizellen aus ionischen und nichtionischen Tensiden eignen sich. Entscheidend ist, dass die Mizelle insgesamt eine Ladung trägt und damit eine eigene Mobilität besitzt.
Arbeitsbedingungen und Bewegung der Mizellen
Apparativ ist die MEKC eine gewöhnliche Kapillarelektrophorese. Man arbeitet mit einer Quarzkapillare und hohen Spannungen im Kilovoltbereich, typischerweise 10 bis 30 kV. Häufig dient ein neutraler bis basischer Puffer wie Boratpuffer um pH 9 als Grundlage. Dort sind die Silanolgruppen der Wand deprotoniert, und ein kräftiger EOF strömt zur Kathode.
Die anionischen SDS-Mizellen wollen elektrophoretisch zur Anode wandern. Ihre Eigenbewegung zeigt also gegen den EOF. Weil der EOF stärker ist, werden sie trotzdem langsam zur Kathode und zum Detektor getragen.
Daraus ergibt sich ein festes Migrationsfenster. Ein Stoff, der nie in die Mizellen geht, wandert mit dem EOF und erscheint zur Zeit \(t_0\). Ein Stoff, der vollständig in den Mizellen steckt, erscheint mit den Mizellen zur Zeit \(t_{mc}\). Alle Neutralstoffe liegen dazwischen.
Die Eigenbewegung geladener Mizellen folgt nicht automatisch dem EOF. Anionische SDS-Mizellen wandern elektrophoretisch zur Anode und erreichen den Detektor an der Kathode nur, weil der EOF sie mitnimmt.
Trennprinzip und Retention
Ein ungeladener Analyt pendelt ständig zwischen wässrigem Puffer und Mizellkern. Im Puffer reist er mit der vollen Geschwindigkeit des EOF. In der Mizelle wird er auf deren langsameres Nettotempo gebremst. Seine Migrationszeit hängt deshalb davon ab, welchen Anteil der Zeit er in den Mizellen verbringt.
Diesen Anteil beschreibt der Verteilungskoeffizient zwischen Mizelle und Puffer:
\[K = \frac{c_{\mathrm{Mizelle}}}{c_{\mathrm{Puffer}}}\]
Dabei ist \(c\) jeweils die Konzentration des Analyten in der Phase. Der Mizellkern ist lipophil. Je lipophiler ein Analyt, desto größer \(K\) und desto später erscheint er. Polare Neutralstoffe bleiben fast ganz im Puffer und kommen kurz nach \(t_0\). So trennt die MEKC auch ungeladene, mäßig polare Analyte, die in der CZE gemeinsam mit dem EOF laufen würden.
In der MEKC gilt für Neutralstoffe: lipophiler heißt mehr Zeit in der Mizelle und damit längere Migrationszeit.
Die Parabene zeigen das sehr anschaulich. Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butyl-4-hydroxybenzoat unterscheiden sich nur in der Länge des Alkylrests am Ester. Jede zusätzliche \(\ce{CH2}\)-Gruppe erhöht die Lipophilie. Die Peaks erscheinen deshalb genau in dieser Reihenfolge.
Die Migrationsreihenfolge ungeladener Analyte aus Strukturformeln abzuleiten ist ein Examensklassiker: Größere Alkylreste bedeuten höhere Lipophilie, stärkere Verteilung in die Mizellen und damit längere Retention. Bei Vitamin-D-Analoga steigt die Retentionszeit mit dem Substituenten an C24 der Seitenkette in der Reihe unsubstituiert < Methyl < Ethyl < n-Butyl.
Retentionsreihenfolge aus Strukturformeln ableiten
Bei Secosteroiden wie den Vitamin-D-Analoga ist das Grundgerüst meist gleich. Nur die Seitenkette unterscheidet sich. So gehst du vor:
- Gemeinsames suchen: Prüfe, welche Teile der Strukturen identisch sind, etwa das Secosteroid-Gerüst mit seinen Hydroxygruppen.
- Unterschied finden: Markiere die abweichenden Substituenten, hier die Alkylgruppe an C24.
- Lipophilie bewerten: Mehr Kohlenstoffatome im Alkylrest bedeuten höhere Lipophilie. Zusätzliche polare Gruppen wie \(\ce{OH}\) senken sie.
- Reihenfolge ableiten: Der lipophilste Analyt verteilt sich am stärksten in die Mizellen und erscheint zuletzt, der polarste zuerst.
Geladene Analyte
Die MEKC trennt nicht nur Neutralstoffe. Geladene Moleküle haben außerhalb der Mizellen eine eigene elektrophoretische Mobilität. Im Puffer wandern sie deshalb nicht einfach mit dem EOF, sondern wie in der CZE nach Ladung und Größe. Zu dieser Wanderung kommt ihre Verteilung in die Mizellen hinzu. Ihre Migrationszeit ergibt sich also aus beiden Effekten und kann auch außerhalb des Fensters zwischen \(t_0\) und \(t_{mc}\) liegen.
Vertiefung: Retentionsfaktor in der MEKC
Analog zur Säulenchromatographie lässt sich ein Retentionsfaktor \(k\) aus der Migrationszeit \(t_R\) berechnen. Weil auch die pseudostationäre Phase wandert, steht im Nenner eine Korrektur mit \(t_{mc}\):
\[k = \frac{t_R - t_0}{t_0\left(1 - \frac{t_R}{t_{mc}}\right)}\]
Für \(t_R \to t_{mc}\) wird \(k\) unendlich groß. Der Analyt steckt dann vollständig in den Mizellen.
Abgrenzung und Anwendungen
MEKC liegt nur vor, wenn ein Tensid oberhalb der CMC Mizellen bildet. Eine Kapillarelektrophorese mit Cyclodextrin im Hintergrundelektrolyten ohne Tensid ist deshalb keine MEKC. Dort bildet das Cyclodextrin Einschlusskomplexe und dient als chiraler Selektor für die Enantiomerentrennung.
Auch ein reiner Boratpuffer bildet keine Mizellen. Ohne Tensidzusatz ist eine Trennung darin eine gewöhnliche CZE. Für die gemeinsame Bestimmung von Anionen und Kationen braucht man keine Mizellen, denn ein kräftiger EOF trägt beide Ionensorten zum Detektor, wie bei der Migration mit EOF beschrieben.
Natriumhexadecylsulfat ist wie SDS ein anionisches Tensid mit unverzweigter Alkylkette. Es besitzt kein Stereozentrum und eignet sich daher nicht als chiraler Selektor. Mizellen aus achiralen Tensiden können Enantiomere nicht unterscheiden.
Die Anwendungen reichen von kleinen Neutralstoffen wie Parabenen und Steroiden bis zu Biomolekülen. Auch Proteine lassen sich durch MEKC trennen.
Quiz
Aussage 1
Damit in der MEKC eine pseudostationäre Phase entsteht, muss das Tensid oberhalb seiner Mizellbildungskonzentration vorliegen.
Erst oberhalb der CMC lagern sich die Tensidmoleküle zu Mizellen zusammen, die Analyte aufnehmen können.
Aussage 2
Geladene Analyte bewegen sich in der MEKC außerhalb der Mizellen entsprechend ihrer eigenen elektrophoretischen Mobilität.
Im Puffer wandern geladene Moleküle wie in der CZE nach Ladung und Größe. Dazu kommt ihre Verteilung in die Mizellen.
Aussage 3
Von zwei ungeladenen Analyten erscheint in der MEKC der lipophilere später am Detektor.
Der lipophilere Analyt hat den größeren Verteilungskoeffizienten, verbringt mehr Zeit in den langsamen Mizellen und wird stärker zurückgehalten.
Aussage 4
Ein Vitamin-D-Analogon mit n-Butylgruppe an C24 erscheint in der MEKC vor dem entsprechenden Methylanalogon.
Die n-Butylgruppe macht das Molekül lipophiler. Es verteilt sich stärker in die Mizellen und erscheint daher nach dem Methylanalogon.
Aussage 5
Eine Enantiomerentrennung mit Cyclodextrin im Hintergrundelektrolyten ohne Tensidzusatz gilt als MEKC.
Ohne Tensid oberhalb der CMC entstehen keine Mizellen. Das Cyclodextrin wirkt hier als chiraler Selektor in einer Kapillarelektrophorese, die keine MEKC ist.
Aussage 6
Anionische SDS-Mizellen bewegen sich elektrophoretisch zur Kathode, also in dieselbe Richtung wie der elektroosmotische Fluss.
Die negativ geladenen Mizellen wandern elektrophoretisch zur Anode, also gegen den EOF. Nur weil der EOF stärker ist, erreichen sie den Detektor an der Kathode.
Aussage 7
Gemischte Mizellen aus ionischen und nichtionischen Tensiden können in der MEKC als pseudostationäre Phase dienen.
Die MEKC ist nicht auf rein ionische Tenside beschränkt. Entscheidend ist, dass die Mizelle insgesamt geladen ist.
Aussage 8
Die MEKC ist ein HPLC-Verfahren, bei dem Mizellen als stationäre Phase in einer gepackten Säule dienen.
Die MEKC ist ein elektrophoretisches Verfahren ohne Pumpe und gepackte Säule. Die Mizellen bilden eine bewegliche, pseudostationäre Phase im Puffer.
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