NIR-Spektroskopie: Spektralbereich, Absorption und Messanordnungen
Wo der NIR-Bereich liegt, welche Schwingungen er anregt, warum die schwache Absorption Messungen ohne Probenvorbereitung erlaubt und welche Messanordnung zu welcher Probe passt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die NIR-Spektroskopie ist eine Schwingungsspektroskopie im Bereich zwischen sichtbarem Licht und MIR, von etwa 12500 bis 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\) bzw. 0,8 bis 2,5 µm.
- NIR-Strahlung hat größere Wellenzahlen als MIR-Strahlung und ist deshalb energiereicher; umgerechnet wird mit \(\tilde{\nu} = 10^{7}/\lambda\) (Wellenzahl in \(\mathrm{cm^{-1}}\), Wellenlänge in nm).
- Im NIR beobachtet man überwiegend Ober- und Kombinationsschwingungen, vor allem von C–H-, O–H- und N–H-Bindungen; gemessen wird Absorption, nicht Laserstreulicht.
- Kleine Absorptionskoeffizienten bedingen eine hohe Eindringtiefe, sodass Proben meist unverdünnt ohne Probenvorbereitung gemessen werden.
- Molekülstruktur, Kristallwasser, Wassergehalt, Lösungsmittelrückstände, Reinheit, Polymorphie und Korngröße verändern das NIR-Spektrum.
- Messanordnungen sind Transmission, diffuse Reflexion (Absorption nicht log-proportional zur Intensität) und Transflexion, die sich für Cremes, Vaselin, Wollwachs und Glycerol 85 % eignet, nicht für geschnittene Eichenrinde.
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Worum es geht
Die Nahinfrarotspektroskopie misst, wie Moleküle Strahlung knapp jenseits des roten Lichts absorbieren. Sie arbeitet schnell, zerstörungsfrei und meist ohne Probenvorbereitung. Deshalb nutzt man sie in der Pharmazie etwa zur Identitätsprüfung von Ausgangsstoffen.
Einordnung der NIR-Spektroskopie
Die NIR-Spektroskopie gehört wie die MIR- und die Raman-Spektroskopie zur Schwingungsspektroskopie. Absorbierte Strahlung regt Schwingungen von Bindungen an, wie in Schwingungsformen und IR-Aktivität beschrieben. Im elektromagnetischen Spektrum liegt der NIR-Bereich zwischen dem sichtbaren Licht und dem mittleren Infrarot (MIR).
Das Europäische Arzneibuch beschreibt die Methode in einer eigenen Monographie. Dazu gehört eine regelmäßige Geräteprüfung, etwa der Wellenlängenrichtigkeit und der photometrischen Linearität. NIR-Banden sind breit und überlagern sich stark. Man wertet die Spektren daher selten Bande für Bande aus. Stattdessen vergleichen chemometrische Rechenmodelle das ganze Spektrum mit Referenzspektren. Was man damit prüft, zeigt die Einheit Pharmazeutische Anwendungen der NIR-Spektroskopie.
Spektralbereich und Energie
Der NIR-Bereich reicht von etwa 12500 bis 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\). Als Wellenlänge ausgedrückt sind das etwa 0,8 bis 2,5 µm, also 800 bis 2500 nm. Auf der kurzwelligen Seite grenzt er an das rote Ende des sichtbaren Lichts. Bei 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\) beginnt das MIR, das bis etwa 400 \(\mathrm{cm^{-1}}\) reicht. Darunter folgt das ferne Infrarot (FIR). Ein Bereich wie 200 bis 20 \(\mathrm{cm^{-1}}\) liegt also im FIR und weit außerhalb des NIR.
Die Energie eines Photons ist der Wellenzahl direkt proportional: \(E = h \cdot c \cdot \tilde{\nu}\). Dabei ist \(h\) das Plancksche Wirkungsquantum, \(c\) die Lichtgeschwindigkeit und \(\tilde{\nu}\) die Wellenzahl (Grundlagen in Elektromagnetische Strahlung). NIR-Strahlung hat größere Wellenzahlen als MIR-Strahlung und ist deshalb energiereicher. Sie überträgt größere Energiebeträge auf die Moleküle. Das reicht für Übergänge über mehrere Schwingungsniveaus.
Wellenzahl und Wellenlänge sind Kehrwerte voneinander. Deshalb dreht sich die Reihenfolge der Grenzen um: 0,8 µm gehört zu 12500 \(\mathrm{cm^{-1}}\), 2,5 µm zu 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\). Da 1 cm genau \(10^{7}\) nm sind, gilt eine einfache Umrechnung.
\[\tilde{\nu}\,[\mathrm{cm^{-1}}] = \frac{10^{7}}{\lambda\,[\mathrm{nm}]}\]
Dieselbe Formel gilt umgekehrt: \(\lambda\) in nm ist \(10^{7}\) geteilt durch die Wellenzahl in \(\mathrm{cm^{-1}}\).
- Angabe prüfen: Eine Bande liegt bei 1700 nm.
- Umrechnen: \(10^{7} / 1700 \approx 5880\,\mathrm{cm^{-1}}\).
- Zuordnen: 5880 \(\mathrm{cm^{-1}}\) liegt zwischen 12500 und 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\), also im NIR.
- Gegenprobe: 4 µm sind 4000 nm und ergeben 2500 \(\mathrm{cm^{-1}}\). Das ist MIR.
Die Grenzen 12500 bis 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\) bzw. 0,8 bis 2,5 µm und die Aussage, dass NIR-Strahlung energiereicher als MIR-Strahlung ist, werden im Examen gerne gefragt. Achte darauf, dass die größere Wellenzahl zur kleineren Wellenlänge und damit zur höheren Energie gehört.
Ober- und Kombinationsschwingungen
Welche Schwingungen diese Energie anregt, folgt aus dem anharmonischen Oszillator (siehe Oberschwingungen und Kombinationsschwingungen). Grundschwingungen, also Übergänge vom Niveau 0 nach 1, liegen im MIR. Im NIR beobachtet man überwiegend Oberschwingungen (0 → 2, 0 → 3) und Kombinationsschwingungen. Bei Letzteren regt ein Photon zwei Schwingungen zugleich an.
Die Niveaus rücken nach oben hin enger zusammen. Die erste Oberschwingung liegt daher etwas unter der doppelten Frequenz der Grundschwingung. Solche Übergänge sind nur wegen der Anharmonizität erlaubt und entsprechend wenig wahrscheinlich.
Am deutlichsten erscheinen sie bei Bindungen mit Wasserstoff, also C–H, O–H und N–H. Diese haben hohe Grundfrequenzen und sind stark anharmonisch. Wasser zeigt so markante Banden bei etwa 1450 nm (erste O–H-Oberschwingung) und 1940 nm (Kombinationsschwingung).
Die NIR-Spektroskopie ist eine Absorptionsmethode. Der Detektor misst, welcher Anteil der eingestrahlten Strahlung fehlt. Anders die Raman-Spektroskopie: Sie erfasst ebenfalls Schwingungen, misst aber das Streulicht eines Lasers.
Absorptionsstärke und Eindringtiefe
Ober- und Kombinationsschwingungen sind schwache Übergänge. NIR-Banden haben deshalb kleine Absorptionskoeffizienten, typischerweise zehn- bis hundertmal kleiner als die Grundschwingungsbanden im MIR. Was nach einem Nachteil klingt, macht die Methode erst praktisch.
Die Eindringtiefe gibt an, wie weit Strahlung in eine Probe gelangt, bevor sie weitgehend absorbiert ist. Je kleiner der Absorptionskoeffizient, desto größer die Eindringtiefe.
NIR-Strahlung dringt daher tief in Festkörper ein, je nach Material bis in den Millimeterbereich. Sie erfasst das Innere eines Pulvers oder einer Tablette und nicht nur die Oberfläche. Im MIR absorbieren Reinsubstanzen dagegen so stark, dass man sie verdünnen muss, etwa im Kaliumbromid-Pressling (Probenvorbereitung im MIR).
Im NIR entfällt dieser Schritt. Proben werden meist unverdünnt und ohne Probenvorbereitung vermessen. Glas absorbiert im NIR kaum, sodass man sogar durch die Wand eines Probengläschens messen kann. Die Probe bleibt unverändert und lässt sich weiterverwenden.
Einflussgrößen auf das Spektrum
Ein NIR-Spektrum spiegelt die ganze Probe wider, nicht nur ihre Moleküle. Chemische und physikalische Eigenschaften gehen gemeinsam ein. Das macht die Methode empfindlich, aber auch anfällig: Zwei Chargen desselben Stoffs können verschiedene Spektren liefern. Besonders prüfungsrelevant ist, dass neben der Molekülstruktur auch Polymorphie, Wasser und die Korngröße das Spektrum verändern.
| Einflussgröße | Art | Warum sie das Spektrum ändert |
|---|---|---|
| Molekülstruktur | chemisch | legt fest, welche C–H-, O–H- und N–H-Gruppen schwingen |
| Kristallwassergehalt | chemisch | gebundenes Wasser liefert eigene O–H-Banden |
| Wassergehalt | chemisch | Feuchte erzeugt starke Banden bei etwa 1450 und 1940 nm |
| Lösungsmittelrückstände | chemisch | Fremdmoleküle bringen eigene X–H-Banden mit |
| Reinheitsgrad | chemisch | Verunreinigungen tragen zusätzliche Banden bei |
| Polymorphie | Festkörper | anderes Kristallgitter ändert Wasserstoffbrücken und Bandenlage |
| Partikel- bzw. Korngröße | physikalisch | ändert die Lichtstreuung und damit den Lichtweg |
Polymorphe Modifikationen enthalten dieselben Moleküle in unterschiedlicher Anordnung im Kristall. Die veränderte Nachbarschaft verschiebt die Schwingungsniveaus leicht. So unterscheidet das NIR-Spektrum Formen, die chemisch identisch sind.
Die Korngröße wirkt rein physikalisch. Feine Pulver haben viele Grenzflächen und streuen stark. Das Licht kehrt nach kurzem Weg zurück. In groben Körnern läuft es länger durch das Material und wird stärker absorbiert. Das gröbere Pulver zeigt daher höhere Absorbanzwerte, und das ganze Spektrum verschiebt sich.
Für die Praxis heißt das: Referenz und Probe müssen vergleichbar sein. Alternativ gleicht man solche Grundlinienverschiebungen vor der Auswertung rechnerisch aus.
Transmission, diffuse Reflexion, Transflexion
Je nach Probe wählt man eine von drei Messanordnungen. Bei der Transmission stehen Quelle und Detektor einander gegenüber. Die Strahlung durchquert die Probe einmal, etwa eine Flüssigkeit in der Küvette oder eine Tablette. Hier gilt das Lambert-Beer-Gesetz: Die Absorbanz \(A = \lg(I_0/I)\) ist proportional zur Konzentration.
Die diffuse Reflexion eignet sich für Pulver und andere streuende Festkörper. Quelle und Detektor liegen auf derselben Seite. Das Licht dringt ein, wird an vielen Körnern gestreut, teilweise absorbiert und tritt in alle Richtungen wieder aus. Man kann sich das wie Licht in Neuschnee vorstellen, das kreuz und quer wandert, bevor es zurückkommt. Gemessen wird die Reflektanz \(R\), aufgetragen als \(\lg(1/R)\).
Bei diffuser Reflexion ist die Absorption nicht proportional zum Logarithmus der Strahlungsintensität. Der Lichtweg im Pulver hat keine definierte Länge, deshalb gilt das Lambert-Beer-Gesetz nicht streng.
Für quantitative Aussagen braucht man daher Kalibrierungen mit Referenzproben oder Korrekturfunktionen wie die nach Kubelka-Munk.
Bei der Transflexion durchstrahlt das Licht eine Probenschicht, trifft dahinter auf einen Reflektor und läuft ein zweites Mal durch die Probe zurück zum Detektor.
Der optische Weg ist also doppelt so lang wie die Schichtdicke. Er ist durch den Abstand zum Reflektor festgelegt. Das funktioniert nur, wenn die Probe die Schicht lückenlos und gleichmäßig füllt und den Reflektor gut benetzt.
Flüssige und halbfeste Proben erfüllen diese Bedingung. Grobe, uneinheitliche Feststoffe tun es nicht. Sie hinterlassen Lufträume und streuen unkontrolliert. Für sie wählt man die diffuse Reflexion.
- Wollwachsalkoholcreme (DAC)
- Glycerol 85 %
- Weißes Vaselin
- Wollwachs
- Geschnittene Drogen wie Eichenrinde
- Grund: unregelmäßige Stücke, keine geschlossene Schicht, kein definierter Lichtweg
Quiz
Aussage 1
Weißes Vaselin lässt sich im NIR-Transflexionsmodus messen, geschnittene Eichenrinde dagegen nicht.
Halbfeste Proben füllen die Schicht vor dem Reflektor gleichmäßig; geschnittene Drogen bilden keine geschlossene Schicht.
Aussage 2
NIR-Strahlung umfasst etwa Wellenlängen von 0,8 bis 2,5 µm.
Das entspricht 800 bis 2500 nm bzw. etwa 12500 bis 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\).
Aussage 3
Bei der Messung in diffuser Reflexion ist die Absorption streng proportional zum Logarithmus der Strahlungsintensität.
Der Lichtweg im Pulver ist nicht definiert; die Absorption ist hier nicht proportional zum Logarithmus der Intensität, Lambert-Beer gilt nicht streng.
Aussage 4
Eine Bande bei 5000 \(\mathrm{cm^{-1}}\) entspricht einer Wellenlänge von 2000 nm und liegt im NIR.
\(10^{7}/5000 = 2000\) nm; 5000 \(\mathrm{cm^{-1}}\) liegt zwischen 12500 und 4000 \(\mathrm{cm^{-1}}\).
Aussage 5
NIR-Strahlung ist energieärmer als MIR-Strahlung, weil sie im Spektrum näher am sichtbaren Licht liegt.
NIR-Strahlung hat größere Wellenzahlen als MIR-Strahlung und ist deshalb energiereicher.
Aussage 6
NIR-Spektren beruhen überwiegend auf Grundschwingungen polarer Bindungen.
Grundschwingungen liegen im MIR. Im NIR beobachtet man überwiegend Ober- und Kombinationsschwingungen.
Aussage 7
Zwei Pulver desselben Arzneistoffs mit unterschiedlicher Korngröße können verschiedene NIR-Spektren liefern.
Die Korngröße ändert die Lichtstreuung und damit den Lichtweg; das Spektrum verschiebt sich.
Aussage 8
Wegen ihrer geringen Eindringtiefe erfasst NIR-Strahlung bei Festkörpern nur die Oberfläche.
Die kleinen Absorptionskoeffizienten bewirken eine hohe Eindringtiefe; NIR-Strahlung erfasst auch das Probeninnere.
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