HPLC-Anlage, Trennsäule und stationäre Phasen
Wie eine HPLC-Anlage aufgebaut ist, wie Umkehrphasen aus Kieselgel entstehen und wie Endcapping, Partikelgröße und Vorsäule die Trennung beeinflussen.
Das Wichtigste in Kürze
- Die HPLC trennt Analyten, indem eine Pumpe die mobile Phase unter hohem Druck durch eine dicht gepackte Säule drückt; Aufbau: Eluentvorrat, Pumpe, Injektor, (Vor-)Säule, Detektor.
- Cyanopropyl-Kieselgel ist mittelpolar und in Normal- und Umkehrphase einsetzbar; Hartparaffin ist als stationäre Phase ungeeignet.
- Umkehrphasen entstehen durch Silanisierung der Silanolgruppen mit Alkylchlorsilanen; die Zahl in RP-18 nennt die C-Atome der Kette.
- Endcapping blockiert Restsilanole und vermindert das Tailing basischer Arzneistoffe wie Amitriptylin.
- Kleinere Partikel erhöhen Trenneffizienz und Rückdruck, nicht aber die Fließgeschwindigkeit; eine konstante Bodenzahl mit Toluen belegt nur unveränderte Packungsqualität.
- Die Vorsäule hält Probenverunreinigungen zurück; Eluenten filtriert man über engporige Glasfritten.
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Worum es geht
Die HPLC ist das Standardverfahren für Gehaltsbestimmungen und Reinheitsprüfungen von Arzneistoffen. Ob ein Peak scharf und symmetrisch erscheint, entscheidet vor allem die Trennsäule mit ihrer stationären Phase. Deshalb lohnt es sich zu verstehen, woraus diese Phase besteht und wie man sie herstellt.
Prinzip und Geräteaufbau
In der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) pumpt man eine flüssige mobile Phase unter hohem Druck durch eine Säule. Diese ist dicht mit sehr feinen Partikeln gepackt. Die Analyten verteilen sich unterschiedlich stark zwischen mobiler und stationärer Phase und verlassen die Säule deshalb nacheinander.
Die Anlage folgt dem Weg des Eluenten. Aus dem Eluentvorrat saugt die Pumpe über eine Fritte an und baut den Druck auf. Der Injektor bringt die Probe über eine Probenschleife in den Strom. Danach folgen Vorsäule und Trennsäule, schließlich der Detektor mit Datensystem.
Die UHPLC arbeitet nach demselben Prinzip, nutzt aber Partikel unter 2 µm. Das erzwingt deutlich höhere Drücke und spezielle Pumpen. Dafür gelingen schärfere Peaks in kürzerer Zeit.
Stationäre Phasen
Die Säulenfüllung ist die stationäre Phase. Sie muss mechanisch druckstabil sein und darf sich im Eluenten nicht lösen. Für die Normalphase dient nicht nur Kieselgel, auch Aluminiumoxid ist geeignet. Für die Umkehrphase verwendet man chemisch modifiziertes Kieselgel.
| Phase | Polarität | Einsatz |
|---|---|---|
| Kieselgel | polar | Normalphase |
| Aluminiumoxid | polar | Normalphase |
| C18- und C30-Kieselgel | unpolar | Umkehrphase |
| Cyanopropyl-Kieselgel | mittelpolar | Normal- und Umkehrphase |
Eine Besonderheit ist Cyanopropyl-Kieselgel. Seine Nitrilgruppen sind polar, die Propylkette unpolar. Mit unpolaren Eluenten arbeitet es daher als Normalphase, mit wässrigen Eluenten als Umkehrphase.
Hartparaffin eignet sich dagegen nicht. Es wäre nur aufgelagert und nicht gebunden. Organische Eluenten würden es lösen und ausspülen, anders als eine kovalent verankerte Alkylkette.
Umkehrphasen und Endcapping
Eine Umkehrphase (RP, reversed phase) trägt längerkettige Kohlenwasserstoffe auf einem polaren Träger. Man erzeugt sie durch Silanisierung. Dabei reagieren die Silanolgruppen (Si–OH) des Kieselgels mit einem Alkylchlorsilan. Chlorwasserstoff wird abgespalten, die Alkylkette hängt über eine Si–O–Si-Brücke fest an der Oberfläche (\(\ce{R3Si}\) steht für die Kieselgeloberfläche):
\[\ce{R3Si-OH + Cl-Si(CH3)2C18H37 -> R3Si-O-Si(CH3)2C18H37 + HCl}\]
Auch Dialkyldichlorsilane wie Dioctyldichlorsilan sind geeignet. Unter mehreren Strukturformeln erkennst du das Reagenz am Siliciumatom mit Chlor als Abgangsgruppe und mindestens einer Alkylkette. Fluoralkane fehlt dieses reaktive Si–Cl. Auch Methylsulfonsäureester mit Ethylenglykolketten liefern keine RP-Phase, denn sie bringen weder Silicium noch eine lange unpolare Kette mit.
Die Zahl in RP-18 oder RP-8 nennt die Zahl der C-Atome der Alkylkette: octadecyl- bzw. octylsilyliertes Kieselgel. Sie ist weder Partikelgröße noch Molmasse eines Polymers.
Die langen Ketten sind sperrig. Deshalb erreichen sie nicht alle Silanolgruppen, ein Teil bleibt frei. Diese Restsilanole sind schwach sauer und liegen teilweise als \(\ce{Si-O-}\) vor.
Nachsilanisieren verbliebener Silanolgruppen mit einem kleinen Silan wie Trimethylchlorsilan. Das kleine Molekül erreicht auch Lücken zwischen den langen Ketten.
\[\ce{R3Si-OH + ClSi(CH3)3 -> R3Si-O-Si(CH3)3 + HCl}\]
Warum ist das wichtig? Amitriptylin ist ein tertiäres Amin und damit eine Base. Im Eluenten ist es protoniert und bindet ionisch an deprotonierte Restsilanole. Diese Bindung löst sich nur langsam. Man kann sich das wie Klettverschluss an einzelnen Stellen vorstellen: Einige Moleküle bleiben hängen und kommen verspätet nach. Der Peak zieht einen Schwanz, das Tailing.
Endcapping beseitigt diese Haftstellen und verbessert die Peaksymmetrie basischer Arzneistoffe. Werden die Aminpeaks einer Säule im Lauf der Zeit immer schlechter, spricht das für zunehmend freie Silanole. Ein Puffer mit pH 9 hilft ebenfalls, denn er drängt die Protonierung des Amins zurück (basenstabiles Säulenmaterial vorausgesetzt). Ein Zusatz von β-Cyclodextrin verbessert die Symmetrie dagegen nicht, denn er ändert nichts an der Wechselwirkung mit den Silanolen. Zum Säure-Base-Verhalten von Aminen siehe Basenstärke aus der Struktur.
Partikelgröße und Säulentest
HPLC-Partikel sind meist kleiner als 25 µm, übliche Werte liegen bei 3 bis 5 µm. Sie können sphärisch oder unregelmäßig gebrochen sein. Je kleiner die Partikel, desto kürzer sind die Diffusionswege. Die Bodenzahl steigt, die Trenneffizienz nimmt zu. Grundlagen zur Bodenzahl findest du dort.
Der Preis ist ein stark steigender Rückdruck, denn die Zwischenräume werden enger. Die Fließgeschwindigkeit steigt bei sonst gleichen Bedingungen dadurch nicht. Auch die Elutionsreihenfolge bleibt gleich, weil sich die Chemie der Phase nicht ändert. Die Empfindlichkeit des Detektors beeinflusst die Trennleistung nicht, sie bestimmt nur, wie kleine Signale noch messbar sind.
Ob eine RP-18-Säule noch gut trennt, prüft man mit einer Testsubstanz wie Toluen. Es ist neutral und unpolar und wird gut retiniert. Bleibt seine Bodenzahl konstant, ist die Packungsqualität unverändert. Daraus folgt aber nicht, dass das Material chemisch unverändert ist. Toluen reagiert kaum auf freie Silanole, Amine zeigen solche Veränderungen dagegen deutlich.
Vorsäule und Filtration
Die Vorsäule ist eine kurze Säule vor der Trennsäule. Sie hält Verunreinigungen der Probe zurück und schont so die teure Trennsäule. Den Druck baut weiterhin die Pumpe auf, und eine Derivatisierung findet in der Vorsäule nicht statt. Ihre Phase kann der Hauptsäule gleichen, muss es aber nicht.
Auch der Eluent kann Partikel enthalten, die die Vorsäule verstopfen. Man filtriert ihn deshalb über engporige Glasfritten, etwa die Ansaugfritte in der Eluentflasche. Zur Entgasung des Eluenten siehe dort.
Quiz
Aussage 1
Eine Vorsäule hält Verunreinigungen der Probe zurück und schont dadurch die Trennsäule.
Genau das ist ihre Funktion; den Druck baut die Pumpe auf.
Aussage 2
Endcapping einer RP-18-Phase verbessert die Peaksymmetrie basischer Analyten wie Amitriptylin.
Es blockiert Restsilanole, an die protonierte Amine sonst ionisch binden und Tailing verursachen.
Aussage 3
Verkleinert man bei sonst gleichen Bedingungen die Partikel der stationären Phase, steigt die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase.
Kleinere Partikel erhöhen Rückdruck und Trenneffizienz, die Fließgeschwindigkeit steigt dadurch nicht.
Aussage 4
Bleibt die mit Toluen bestimmte Bodenzahl einer RP-18-Säule konstant, ist das Säulenmaterial nachweislich chemisch unverändert.
Eine konstante Bodenzahl belegt nur eine unveränderte Packungsqualität; chemische Veränderungen wie freie Silanole zeigt Toluen kaum.
Aussage 5
Die Zahl 18 in der Bezeichnung RP-18 gibt den Partikeldurchmesser des Sorbens in Mikrometern an.
Die 18 nennt die C-Atome der Octadecylkette; RP-18 ist octadecylsilyliertes Kieselgel.
Aussage 6
Cyanopropyl-modifiziertes Kieselgel lässt sich sowohl als Normalphase als auch als Umkehrphase einsetzen.
Polare Nitrilgruppe und unpolare Propylkette erlauben beide Modi, je nach Eluent.
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