Kalibrierung, Relativmethoden und Standards
Wie man Messsignale über eine Kalibrierung in Konzentrationen übersetzt, welche Verfahren das brauchen und wie externe und interne Standards dabei helfen.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Kalibrierung ermittelt den funktionalen Zusammenhang zwischen Messsignal und Analytkonzentration. Die Validierung belegt die Eignung des ganzen Verfahrens.
- Relativmethoden wie UV-Photometrie, Fluorimetrie, AAS, quantitative IR und HPLC-UV brauchen eine Kalibrierung mit der zu bestimmenden Substanz.
- Rückführbarkeit ist eine ununterbrochene Kette dokumentierter Vergleiche vom Arbeitsstandard über den Primärstandard bis zur SI-Einheit.
- Ein interner Standard wird allen Lösungen in gleicher Konzentration zugesetzt, im selben Lauf gemessen und korrigiert Injektionsdosierfehler.
- Theobromin dient als interner Standard für Theophyllin. Ein Kalibrierstandard darf also eine andere Struktur haben als der Analyt.
Worum es geht
Ein Photometer liefert eine Absorption, ein HPLC-Detektor eine Peakfläche. Eine Konzentration liefern beide nicht. Die Kalibrierung übersetzt das Signal in einen Gehalt. Erst damit wird eine Gehaltsbestimmung wie die von Theophyllin in einer Retardtablette möglich.
Kalibrieren und Validieren
Die Kalibrierung ermittelt den funktionalen Zusammenhang zwischen einer Messgröße und der Konzentration des Analyten. Man misst dafür Lösungen bekannter Konzentration und trägt das Signal gegen die Konzentration auf. In der Spektralphotometrie heißt Kalibrieren also: die Absorption in Abhängigkeit von der Konzentration bestimmen. Den theoretischen Hintergrund liefert das Lambert-Beer-Gesetz. Wie man die Kalibriergerade aufstellt und bewertet, zeigt die Einheit zur linearen Kalibrierung.
Die Validierung belegt dokumentiert, dass ein Analysenverfahren für seinen Zweck geeignet ist. Dazu prüft man Kenngrößen wie Präzision, Richtigkeit, Linearität und Robustheit.
Die Kalibrierung ist damit ein Arbeitsschritt innerhalb einer Messung. Die Validierung bewertet das ganze Verfahren. Welche Parameter dazu gehören, behandelt die Einheit zu den Validierungsparametern.
Relativmethoden
Bei einer Absolutmethode folgt der Gehalt direkt aus Masse oder Stöchiometrie. Ein Beispiel ist die Gravimetrie. Bei einer Relativmethode hängt das Signal zusätzlich von stoffspezifischen Größen ab, etwa vom Absorptionskoeffizienten. Diese Größen kennt man nicht genau genug. Deshalb braucht jede Relativmethode eine Kalibrierung mit der zu bestimmenden Substanz.
| Verfahren | Gemessenes Signal |
|---|---|
| UV-Photometrie | Absorption |
| Fluorimetrie | Fluoreszenzintensität |
| Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) | Absorption der Atome |
| IR-Spektroskopie (quantitativ) | Bandenabsorption |
| HPLC mit UV-Detektion | Peakfläche |
Auch die HPLC-UV gehört dazu. Die Säule trennt nur. Wie stark ein Peak ausfällt, bestimmt die UV-Absorption der jeweiligen Substanz.
Standards und Referenzsubstanzen
Für die Kalibrierung braucht man Referenzsubstanzen mit genau bekanntem Gehalt. Ein primärer Standard hat höchste Reinheit und ist direkt an SI-Einheiten angebunden. Ein sekundärer Standard oder Arbeitsstandard wird gegen einen Primärstandard eingestellt. Die Rückführbarkeit verbindet beide: Sie ist eine ununterbrochene Kette dokumentierter Vergleiche bis zur SI-Einheit. Jedes Glied trägt eine angegebene Messunsicherheit.
Externer und interner Standard
Beim externen Standard misst man Kalibrierlösungen getrennt von der Probe. Beim internen Standard setzt man allen Proben- und Kalibrierlösungen dieselbe Menge einer Hilfssubstanz zu. Sie wird im selben Lauf wie der Analyt gemessen.
- eigene Läufe mit Kalibrierlösungen
- Auswertung über die Peakfläche des Analyten
- Dosierfehler gehen voll ins Ergebnis ein
- in gleicher Konzentration allen Lösungen zugesetzt
- Auswertung über das Flächenverhältnis Analyt zu Standard
- korrigiert Dosierfehler bei der Injektion
Die Korrektur funktioniert wie eine Wägung mit Gegengewicht. Injiziert man 10 % zu wenig, schrumpfen beide Peaks um 10 %. Ihr Verhältnis bleibt gleich.
Ein guter interner Standard ähnelt dem Analyten chemisch. Er verhält sich dann bei Aufarbeitung und Messung ähnlich. Er muss aber chromatographisch getrennt erscheinen und darf in der Probe nicht vorkommen. Theobromin eignet sich so als interner Standard für die HPLC-Gehaltsbestimmung von Theophyllin.
Das Beispiel zeigt auch: Ein Kalibrierstandard kann eine andere chemische Struktur haben als der Analyt. In der Titrimetrie stellt man eine Maßlösung oft mit einer Urtitersubstanz ein. Zwingend ist das nicht. Auch eine bereits eingestellte Maßlösung kann als Vergleich dienen.
Eine Urtitersubstanz stellt den Titer einer Maßlösung ein. Sie wird der Probe nicht zugesetzt und heißt deshalb nicht interner Standard.
Quiz
Aussage 1
Die Fluorimetrie ist eine Relativmethode und erfordert eine Kalibrierung mit der zu bestimmenden Substanz.
Die Fluoreszenzintensität hängt von stoffspezifischen Größen ab. Deshalb muss man mit dem Analyten selbst kalibrieren.
Aussage 2
Unter Validierung versteht man die Ermittlung der Absorption in Abhängigkeit von der Konzentration.
Das ist die Kalibrierung. Die Validierung belegt, dass das gesamte Verfahren für seinen Zweck geeignet ist.
Aussage 3
Ein interner Standard wird in einem eigenen chromatographischen Lauf getrennt von der Probe gemessen.
Der interne Standard wird der Lösung zugesetzt und im selben Lauf wie der Analyt gemessen. Getrennte Läufe kennzeichnen den externen Standard.
Aussage 4
Theobromin eignet sich als interner Standard für die HPLC-Gehaltsbestimmung von Theophyllin.
Beide Xanthine sind chemisch ähnlich, lassen sich aber chromatographisch trennen. Theobromin kommt in der Probe nicht vor.
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