Normalphasen und Umkehrphasen
Normal- und Umkehrphasenchromatographie unterscheiden sich darin, ob die stationäre oder die mobile Phase polarer ist, und das bestimmt die Elutionsreihenfolge.
Das Wichtigste in Kürze
- Normal- und Umkehrphase unterscheiden sich im Polaritätsverhältnis: An der NP ist die stationäre Phase polarer als die mobile, an der RP ist es umgekehrt.
- An der Normalphase eluieren lipophile Stoffe zuerst, an der Umkehrphase polare.
- Unmodifiziertes Kieselgel ist polar und eine Normalphase; Amine binden stark an seine freien Silanolgruppen.
- RP-18 (Octadecylsilyl-Kieselgel) ist die typische Umkehrphase; an RP ist Wasser schwächer eluierend als Methanol.
- Cyanopropyl-Kieselgel ist mittelpolar und je nach Fließmittel als NP oder RP einsetzbar.
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Worum es geht
Ob ein Stoff früh oder spät eluiert, hängt davon ab, wie sich die Polarität von stationärer und mobiler Phase zueinander verhält. Dieses Verhältnis unterscheidet die Normal- von der Umkehrphasenchromatographie. Fast jede Gehaltsbestimmung per HPLC im Arzneibuch läuft an einer Umkehrphase.
Normalphase
Bei der Normalphasenchromatographie (NP) ist die stationäre Phase polarer als die mobile Phase. Typisch ist eine polare, unbehandelte Oberfläche. Darüber läuft ein eher unpolares Fließmittel, etwa n-Hexan mit etwas Ethylacetat. Die Trennung beruht meist auf Adsorption.
Ein Analyt haftet umso fester, je polarer er ist. Polare Stoffe werden also stärker retiniert. Lipophile Stoffe bleiben lieber im unpolaren Fließmittel und eluieren deshalb zuerst.
Kieselgel
Die klassische Normalphase ist unmodifiziertes Kieselgel. Seine Oberfläche ist dicht mit Hydroxygruppen besetzt. Das macht es polar statt lipophil, deshalb ist reines Kieselgel immer eine Normalphase.
Eine Silanolgruppe ist eine \(\ce{Si-OH}\)-Gruppe an der Kieselgeloberfläche. Sie ist schwach sauer und bildet Wasserstoffbrücken.
Basische Stoffe wie Amine binden besonders fest an freie Silanolgruppen. Das verzögert sie stark und kann zu Tailing führen.
Umkehrphase
Bei der Umkehrphasenchromatographie (RP, reversed phase) sind die Polaritäten vertauscht. Man bindet längerkettige Kohlenwasserstoffe über \(\ce{Si-O-Si}\)-Brücken an die Kieselgeloberfläche. Wichtigster Vertreter ist RP-18, Octadecylsilyl-Kieselgel mit \(\ce{C18}\)-Ketten. Die Oberfläche wirkt dann wie ein dünner Ölfilm. Polysiloxane zählen dagegen nicht zu den Umkehrphasen, sie dienen vor allem als stationäre Phasen der Gaschromatographie.
Die mobile Phase ist hier stets polarer als die stationäre. Man verwendet polare Gemische aus Wasser mit Methanol oder Acetonitril. n-Hexan passt nicht dazu, denn es mischt sich nicht mit Wasser. Polare Stoffe eluieren nun vor den unpolaren. Die Reihenfolge ist also gegenüber der Normalphase umgekehrt.
Daraus folgt die Elutionsstärke: An RP ist Wasser das schwächste Fließmittel. Methanol eluiert stärker, weil es unpolarer ist. Mehr Methanol im Gemisch verkürzt also die Retention. Mehr dazu bei der eluotropen Reihe, Säulentypen bei den HPLC-Phasen.
Cyanopropyl-Phasen
Cyanopropyl-Kieselgel trägt \(\ce{Si-(CH2)3-C#N}\)-Gruppen. Die Nitrilgruppe ist polar, die Propylkette unpolar. Insgesamt ist die Phase mittelpolar.
Welche Rolle sie spielt, entscheidet das Fließmittel. Mit n-Hexan ist sie polarer als die mobile Phase und arbeitet als Normalphase. Mit Wasser-Methanol ist sie unpolarer und arbeitet als Umkehrphase. Cyanopropyl-Kieselgel ist damit für beide Verfahren einsetzbar.
Quiz
Aussage 1
Erhöht man an einer RP-18-Säule den Wasseranteil im Methanol-Wasser-Gemisch, eluieren die Analyten schneller.
An der Umkehrphase hat Wasser die geringere Elutionsstärke. Mehr Wasser verlängert die Retention, mehr Methanol verkürzt sie.
Aussage 2
An einer Normalphase aus Kieselgel verlässt ein lipophiler Analyt die Säule vor einem polaren.
Die polare stationäre Phase hält polare Stoffe stärker zurück, lipophile eluieren zuerst.
Aussage 3
Cyanopropyl-Kieselgel kann mit n-Hexan als Normalphase und mit wässrigem Methanol als Umkehrphase eingesetzt werden.
Die mittelpolare Phase ist polarer als n-Hexan und unpolarer als wässrige Gemische, das Fließmittel bestimmt die Rolle.
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