HPLC und Methodenwahl in der Arzneimittelprüfung
Wie man aus der Struktur eines Analyten ableitet, ob HPLC oder ein anderes Verfahren eine Trenn- oder Prüfaufgabe löst, am Beispiel von Hydrocortison, Proteinen und Metallspuren.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Methodenwahl in der Arzneimittelprüfung folgt der Struktur des Analyten: Ladung, Flüchtigkeit, Molekülgröße und Polarität.
- Hydrocortison und Hydrocortisonacetat sind neutral und unterscheiden sich nur an C-21 (freie OH-Gruppe gegen Acetylester).
- Beide trennt man am besten per RP-HPLC mit Methanol/Wasser; das lipophilere Acetat eluiert nach Hydrocortison.
- Proteine wie Humaninsulin und Trastuzumab lassen sich mittels HPLC trennen, etwa nach Größe oder an der Umkehrphase.
- Die AAS mit Acetylen-Lachgas-Flamme zerstört die Probe; Blei- und Nickelspuren lassen sich nicht polarimetrisch bestimmen, da Metallionen nicht optisch aktiv sind.
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Worum es geht
Viele Monographien der Arzneibücher setzen die HPLC für die Qualitätskontrolle ein. Welches Verfahren eine Aufgabe wirklich löst, entscheidet die Struktur des Analyten: Ladung, Flüchtigkeit, Größe und Polarität. Das braucht man täglich in der Arzneimittelprüfung, etwa bei einer Cortison-Creme.
Identität, Reinheit, Gehalt
Die HPLC beantwortet in einem Lauf drei Fragen. Sie trennt die Probe in Lösung und bei moderater Temperatur. Danach liefert jeder Stoff einen eigenen Peak, den man zuordnen und vermessen kann.
| Prüfung | Was man auswertet | Beispiel |
|---|---|---|
| Identität | Retentionszeit im Vergleich zur Referenzsubstanz, oft zusätzlich das UV-Spektrum | Wirkstoffpeak bei gleicher Zeit wie der Standard |
| Reinheit | Zusatzpeaks verwandter Substanzen und ihre Flächen | Abbau- oder Syntheseprodukte neben dem Hauptpeak |
| Gehalt | Peakfläche im Vergleich zu einem Standard bekannter Konzentration | Wirkstoffmenge pro Tablette |
Die Stärke der Methode liegt darin, auch sehr ähnliche Moleküle zu trennen. Wie man UV-Spektren dabei aufnimmt, steht bei den HPLC-Detektoren.
Trennung strukturverwandter Arzneistoffe
Ein Lehrbeispiel ist das Paar Hydrocortison und Hydrocortisonacetat. Beide haben dasselbe Steroidgerüst mit der 3-Keto-4-en-Struktur. Der einzige Unterschied sitzt an C-21: Hydrocortison trägt dort eine freie Hydroxygruppe (\(\ce{CH2OH}\)), das Acetat einen Essigsäureester (\(\ce{CH2-O-CO-CH3}\)).
Durch die Veresterung verschwindet ein Wasserstoffbrücken-Donor, und eine zusätzliche Methylgruppe kommt hinzu. Deshalb ist Hydrocortisonacetat lipophiler als Hydrocortison. Beide Moleküle sind neutral. Sie unterscheiden sich also nur in ihrer Polarität.
Vom Strukturbild zum Verfahren
Aus den Strukturformeln leitet man die Methode Schritt für Schritt ab:
- Ladung: Ionische Analyten trennt man per Ionenaustausch oder Ionenpaarchromatographie. Beide Steroide sind ungeladen, das scheidet aus.
- Flüchtigkeit: Für die Gaschromatographie muss der Stoff unzersetzt verdampfen. Die Steroide sind mit Molmassen um 360 bis 400 g/mol und mehreren polaren Gruppen schwer flüchtig und thermisch empfindlich.
- Größe: Die Größenausschlusschromatographie lohnt sich erst bei Makromolekülen. Hier liegen zwei kleine Moleküle fast gleicher Größe vor.
- Polarität: Der Unterschied an C-21 ist ein reiner Polaritätsunterschied. Ihn nutzt die HPLC an Umkehrphase am besten.
Auf einer C18-Phase mit Methanol/Wasser als mobiler Phase verteilen sich beide Stoffe zwischen unpolarer Säule und polarem Eluenten. Das lipophilere Acetat haftet stärker an den Alkylketten und wird länger zurückgehalten. Man kann sich die C18-Ketten wie einen fettigen Teppich vorstellen, an dem das Acetat länger kleben bleibt. Detektiert wird über die Enon-Struktur im UV um 240 nm. Die Grundlagen dazu erklärt die Seite zur Retention an Normal- und Umkehrphase.
An der Umkehrphase eluiert zuerst das polarere Hydrocortison, danach das lipophilere Hydrocortisonacetat. Mehr Methanol im Eluenten verkürzt beide Retentionszeiten.
Proteine
Die HPLC trennt auch Makromoleküle. Humaninsulin ist ein kleines Peptidhormon mit 51 Aminosäuren und rund 5,8 kDa. Trastuzumab ist ein monoklonaler IgG-Antikörper gegen HER2 mit etwa 148 kDa. Beide Proteine lassen sich mittels HPLC voneinander trennen.
Dafür gibt es mehrere Wege. Der große Massenunterschied macht die Größenausschlusschromatographie im HPLC-Format naheliegend: Der Antikörper eluiert dort vor dem Insulin. Daneben trennt die Umkehrphase Proteine nach ihrer Hydrophobie, meist an weitporigen Phasen mit Acetonitril-Gradient. Für den Gehalt von Insulin ist die RP-HPLC das Standardverfahren. Die Gaschromatographie kommt für Proteine nie in Frage, da sie nicht verdampfbar sind. Mehr zur Trennung nach Größe steht bei der Ausschlusschromatographie von Makromolekülen.
Ungeeignete Prüfmethoden
Zur Methodenwahl gehört auch zu erkennen, was ein Verfahren nicht kann. Zwei Methoden der Arzneimittelprüfung werden dabei gern überschätzt.
Die Atomabsorptionsspektrometrie mit Acetylen-Lachgas-Flamme (\(\ce{C2H2}\)/\(\ce{N2O}\)) arbeitet bei fast 3000 °C. Die Flamme zerlegt alle Moleküle der Probe in freie Atome. Die AAS misst so den Gehalt einzelner Elemente. Sie zerstört die Probe und kann Verunreinigungen deshalb nicht zerstörungsfrei abtrennen. Details zur Flamme stehen bei der Atomisierung.
Die Polarimetrie misst die Drehung linear polarisierten Lichts durch chirale Moleküle. Metallionen wie \(\ce{Pb^2+}\) oder \(\ce{Ni^2+}\) sind nicht optisch aktiv. Spuren von Blei und Nickel lassen sich daher nicht polarimetrisch quantifizieren. Wofür die Methode taugt, zeigt die Seite zu Identität und Gehalt per Polarimetrie.
| Methode | Misst | Geeignet für | Ungeeignet für |
|---|---|---|---|
| HPLC | getrennte Peaks einzelner Stoffe | Abtrennen und Bestimmen organischer Verunreinigungen | flüchtige Gase |
| AAS | Elementgehalt nach Atomisierung | Metallspuren wie Blei und Nickel | zerstörungsfreie Abtrennung |
| Polarimetrie | optische Drehung chiraler Stoffe | Identität und Gehalt optisch aktiver Wirkstoffe | Schwermetallspuren |
Quiz
Aussage 1
An einer C18-Phase mit Methanol/Wasser erscheint der Peak von Hydrocortisonacetat vor dem von Hydrocortison.
Das Acetat ist lipophiler und wird an der Umkehrphase stärker zurückgehalten. Hydrocortison eluiert zuerst.
Aussage 2
Nickelspuren in einem Wirkstoff lassen sich polarimetrisch nicht quantifizieren, weil \(\ce{Ni^2+}\) nicht optisch aktiv ist.
Die Polarimetrie erfasst nur chirale, optisch aktive Stoffe. Metallionen drehen polarisiertes Licht nicht.
Aussage 3
Humaninsulin und Trastuzumab lassen sich als Proteine nicht mittels HPLC voneinander trennen.
Beide Proteine lassen sich per HPLC trennen, zum Beispiel nach Größe oder an einer weitporigen Umkehrphase.
Aussage 4
Weil Hydrocortison und sein 21-Acetat ungeladen und schwer flüchtig sind, ist die Umkehrphasen-HPLC für ihre Trennung besser geeignet als Ionenaustausch oder GC.
Ohne Ladung greift der Ionenaustausch nicht, und die GC verlangt verdampfbare Stoffe. Der reine Polaritätsunterschied passt zur RP-HPLC.
Aussage 5
Hydrocortison und Hydrocortisonacetat unterscheiden sich strukturell nur in der Gruppe an C-21.
Hydrocortison trägt an C-21 eine freie \(\ce{CH2OH}\)-Gruppe, das Acetat einen Essigsäureester. Das übrige Gerüst ist identisch.
Aussage 6
Mit der AAS in der Acetylen-Lachgas-Flamme lassen sich Verunreinigungen zerstörungsfrei aus einem Wirkstoff abtrennen.
Die Flamme atomisiert die Probe und zerstört sie dabei. Die AAS bestimmt Elementgehalte, eine zerstörungsfreie Abtrennung leistet etwa die HPLC.
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