Isoelektrische Fokussierung
Die isoelektrische Fokussierung trennt Proteine in einem pH-Gradienten nach ihrem isoelektrischen Punkt und dient der Analyse von Isoformen und der pI-Bestimmung.
Das Wichtigste in Kürze
- Die isoelektrische Fokussierung (IEF) trennt amphotere Stoffe wie Proteine in einem pH-Gradienten nach ihrem isoelektrischen Punkt.
- Der Gradient ist an der Anode sauer und an der Kathode basisch. Jedes Protein wandert dorthin, wo pH und pI übereinstimmen, und bleibt dort ladungsfrei stehen.
- Je flacher der pH-Gradient, desto weiter liegen Proteine mit ähnlichem pI auseinander und desto höher ist die Auflösung.
- Den Gradienten bilden mobile Trägerampholyte: niedermolekulare Oligoaminooligocarbonsäuren unterschiedlicher Kettenlänge, die sich im Feld an ihrem jeweiligen pI anordnen.
- Proteine bleiben nativ ohne SDS. Die IEF läuft im Gel oder als kapillare IEF, die keinen starken EOF für den Gradienten braucht.
- Die IEF trennt Proteinisoformen unterschiedlicher Ladung und bestimmt den pI über eine Kalibriergerade aus Markerproteinen.
Dieses Kapitel ist für Supporter
Relaxed ins Stex ist ein kleines, unabhängiges Projekt. Mit einem Zugang unterstützt du uns und schaltest das ganze 1. Staatsexamen frei. ❤️
Bitte bestätige zuerst deine E-Mail-Adresse
Wir haben dir einen Link geschickt. Erst mit bestätigter E-Mail-Adresse kannst du einen Zugang freischalten und nutzen.
Worum es geht
Proteine tragen saure und basische Gruppen. Ihre Ladung hängt deshalb vom pH-Wert ab. Die isoelektrische Fokussierung nutzt das und gehört zu den elektrophoretischen Verfahren, mit denen man biotechnologische Arzneistoffe wie Erythropoetin oder Antikörper auf Ladungsvarianten prüft.
Trennprinzip
Proteine sind amphotere Stoffe mit Carboxy- und Aminogruppen. Ihre Nettoladung wird am isoelektrischen Punkt (pI) null. Die isoelektrische Fokussierung (IEF) trennt Proteine und andere Ampholyte in einem pH-Gradienten nach genau diesem pI.
Der Gradient verläuft vom sauren Bereich an der Anode zum basischen Bereich an der Kathode. Ein Protein im sauren Teil liegt unterhalb seines pI und ist positiv geladen. Es wandert zur Kathode, also zu höheren pH-Werten. Startet es im basischen Teil, ist es negativ geladen und wandert zur Anode. Unterwegs nimmt die Ladung ab. Am pI ist sie null, und das Protein bleibt stehen.
Diffundiert ein Molekül aus seiner Bande heraus, erhält es sofort wieder Ladung und wird zurückgezogen. Man kann sich das wie eine Kugel in einer Talsohle vorstellen. So entstehen sehr scharfe Banden. Die Endposition hängt nur vom pI ab, nicht vom Startort.
Auflösung und Steilheit
Wie weit zwei Banden auseinanderliegen, bestimmt die Steilheit des Gradienten. Ein flacher Gradient verteilt einen kleinen pH-Bereich auf dieselbe Strecke. Zwei Proteine mit pI 5,0 und 5,2 liegen im Gradienten pH 3 bis 10 dicht beieinander. Im Gradienten pH 4 bis 6 rücken sie rund dreieinhalbmal weiter auseinander. Je flacher der Gradient, desto besser trennt die IEF also ähnliche pI-Werte.
Formate und Abgrenzung
Klassisch läuft die IEF im Gel, meist in großporigem Polyacrylamid- oder Agarosegel ohne Siebeffekt. Sie ist aber nicht auf ein Format beschränkt und funktioniert auch als kapillare IEF (cIEF). Dort bauen die Trägerampholyte den Gradienten selbst auf. Ein starker elektroosmotischer Fluss ist dafür nicht nötig. Meist unterdrückt man ihn sogar mit beschichteten Kapillaren. Erst nach der Fokussierung schiebt man die Banden am Detektor vorbei.
Fokussiert werden nur Ampholyte. Einfache Anionen und Kationen haben keinen pI und wandern bis zur Elektrode. Die Trennung beruht allein auf der Wanderung im elektrischen Feld. Anders als bei der Ionenaustauschchromatographie gibt es keine reversible Bindung an eine stationäre Phase.
Für die IEF werden Proteine nicht mit SDS und Dithiothreitol denaturiert. SDS würde die Eigenladung mit negativer Ladung überdecken, und der pI ginge verloren.
pH-Gradient
Ohne stabilen pH-Gradienten gibt es keine Fokussierung. Er entsteht meist aus Trägerampholyten, die frei beweglich und damit mobil sind.
Gemisch vieler niedermolekularer Oligoaminooligocarbonsäuren (Polyaminocarbonsäuren) unterschiedlicher Kettenlänge. Jede Komponente hat einen etwas anderen pI und puffert an diesem pI gut.
Der Gradient baut sich im elektrischen Feld von selbst auf:
- Start: Das Ampholytgemisch ist gleichmäßig im Gel oder in der Kapillare verteilt. Der pH ist überall gleich.
- Spannung: Die Anode taucht in Säure, etwa Phosphorsäure, die Kathode in Lauge, etwa Natronlauge.
- Sortieren: Jedes Ampholytmolekül wandert zu seinem eigenen pI. Saure Komponenten sammeln sich an der Anode, basische an der Kathode.
- Gradient: Dort puffert jede Komponente ihre Umgebung. Aus vielen eng benachbarten pI-Werten entsteht ein stufenloser pH-Verlauf.
Die Proteine fokussieren dann in diesem Gradienten an ihrem pI. Neben mobilen Trägerampholyten gibt es immobilisierte pH-Gradienten. Bei ihnen sind die puffernden Gruppen fest an das Gel gebunden. Die Kapillarzonenelektrophorese arbeitet dagegen mit einem Puffer konstanten pH-Werts und braucht keine Trägerampholyte.
Anwendungen
Viele Proteine kommen als Isoformen vor. Sie unterscheiden sich oft nur in wenigen geladenen Gruppen, etwa durch Deamidierung, Phosphorylierung oder unterschiedlich viele Sialinsäurereste. Die Masse ändert sich dabei kaum, der pI aber messbar. Die IEF trennt solche Ladungsvarianten deshalb auch dort, wo die SDS-PAGE nur eine Bande zeigt. Beispiele sind die Glykoformen von Erythropoetin und die Ladungsvarianten monoklonaler Antikörper. In der zweidimensionalen Elektrophorese bildet die IEF die erste Dimension, danach trennt die SDS-PAGE nach Masse.
Außerdem bestimmt die IEF den pI eines Proteins. Dazu laufen Markerproteine mit bekanntem pI mit. Im linearen Gradienten ergibt die Auftragung von pI gegen Laufstrecke eine Kalibriergerade.
- Marker ablesen: Marker A steht bei 1,5 cm mit pI 4,5, Marker B bei 9,5 cm mit pI 8,5.
- Steigung berechnen: (8,5 − 4,5) / (9,5 cm − 1,5 cm) = 0,5 pH-Einheiten pro cm.
- Probe einsetzen: Die Bande liegt bei 5,1 cm. pI = 4,5 + 0,5 · (5,1 − 1,5) = 6,3.
Quiz
Aussage 1
Mit der IEF lassen sich Isoformen eines Proteins trennen, die sich etwa durch die Zahl der Sialinsäurereste unterscheiden.
Solche Isoformen haben fast gleiche Masse, aber verschiedene Ladung und damit verschiedene pI-Werte.
Aussage 2
Trägerampholyte sind ein Gemisch niedermolekularer Oligoaminooligocarbonsäuren unterschiedlicher Kettenlänge.
Die Komponenten haben leicht verschiedene pI-Werte, ordnen sich im Feld an und puffern dort. So entsteht der pH-Gradient.
Aussage 3
Ein möglichst steiler pH-Gradient verbessert die Trennung zweier Proteine mit sehr ähnlichem pI.
Umgekehrt: Ein flacher Gradient verteilt einen kleinen pH-Bereich auf dieselbe Strecke und trennt ähnliche pI-Werte besser.
Aussage 4
Vor der isoelektrischen Fokussierung werden Proteine mit SDS beladen, damit sie einheitlich geladen sind.
SDS würde die Eigenladung überdecken und den pI unkenntlich machen. Die IEF arbeitet mit nativen Proteinen ohne SDS und Dithiothreitol.
Aussage 5
Ein Protein, das sich in einem Bereich mit pH unterhalb seines pI befindet, ist positiv geladen und wandert in Richtung Kathode.
Unterhalb des pI überwiegt die positive Ladung. Das Protein wandert zur Kathode, also zu höheren pH-Werten, bis es seinen pI erreicht.
Aussage 6
Bei der kapillaren IEF wird der pH-Gradient durch einen starken elektroosmotischen Fluss aufgebaut.
Den Gradienten bauen die Trägerampholyte im Feld selbst auf. Ein starker EOF ist nicht nötig und wird meist sogar unterdrückt.
Fehler entdeckt oder eine Idee? Wir verbessern die Inhalte laufend. Melde es uns gerne über dieses Formular ❤️
Teile der Inhalte wurden mithilfe von KI-Systemen erstellt und werden fortlaufend redaktionell geprüft. Trotz Sorgfalt können Fehler enthalten sein. Wichtige Informationen bitte anhand offizieller Quellen prüfen. Relaxed ins Stex ist ein unabhängiges Angebot und steht in keiner Kooperation mit dem IMPP. Das Angebot ist weder vom IMPP autorisiert noch mit diesem verbunden.