Kapillarzonenelektrophorese: Trennbarkeit von Analyten
Welche Analytpaare die Kapillarzonenelektrophorese in freier Lösung trennt und wie man das an der Strukturformel abliest.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eine trägerfreie Zonenelektrophorese in einer Kapillare mit einheitlichem Puffer und die Grundform der CE.
- Trennbar sind Paare, bei denen mindestens ein Partner geladen ist: Homologe wie 2-Methyl-/2-Ethylbenzoesäure, Stellungsisomere wie 2-/4-Chlorbenzoesäure und Paare verschiedener Ladung wie Benzoesäure/Phthalsäure.
- Paare aus Neutralstoff und Ion wie Benzylalkohol/Benzoesäure oder Anilin/Benzylamin sind trennbar, weil nur das Ion eine eigene Mobilität hat.
- Neutralstoffe wie Dichlorbenzole, Methylchlorbenzoate, Steroide oder Polyethylenglycol wandern gemeinsam mit dem EOF und erscheinen als ein Peak.
- Bei pH 3 sind Parabene ungeladen und nicht trennbar. Neutralstoffe trennt erst ein Micellbildner (MEKC).
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Worum es geht
Die Kapillarzonenelektrophorese trennt Stoffe allein nach ihrer Wanderung im elektrischen Feld. Ob ein Analytpaar trennbar ist, folgt deshalb aus der Ladung seiner funktionellen Gruppen im Puffer. Diese Beurteilung brauchst du für die Reinheitsprüfung und die Gehaltsbestimmung ionisierbarer Arzneistoffe.
Zonenelektrophorese in freier Lösung
Bei der Zonenelektrophorese füllt ein einheitlicher Puffer das gesamte Trennsystem. Die Probe wird als schmale Startzone aufgegeben. Im elektrischen Feld wandert jede geladene Komponente mit eigener Geschwindigkeit. Diese hängt von Ladung und Größe ab, also von der elektrophoretischen Mobilität. So ziehen die Komponenten zu getrennten Zonen auseinander, ähnlich wie Läufer, die gemeinsam starten und sich nach ihrem Tempo verteilen.
Läuft die Trennung in reiner Pufferlösung ohne festes Medium, spricht man von trägerfreier Elektrophorese oder Elektrophorese in freier Lösung. Bei der Trägerelektrophorese wandern die Ionen dagegen durch ein Gel oder Papier. Dieses Medium siebt zusätzlich nach Molekülgröße.
Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eine trägerfreie Zonenelektrophorese in einer pufferbefüllten Quarzkapillare. Sie trennt Analyte allein nach ihrer Mobilität in freier Lösung.
Die CZE ist die Grundform der Kapillarelektrophorese, abgekürzt CE für capillary electrophoresis. Varianten wie die MEKC oder die Isotachophorese verändern Puffer oder Elektrolytsystem.
Trennbare geladene Analyte
Weil die CZE nur nach Mobilität trennt, entscheidet eine Frage: Trägt der Analyt im Puffer eine Ladung? In einem Phosphatpuffer um pH 7 sind Carbonsäuren deprotoniert und aliphatische Amine protoniert. Wie man die Ladung aus pKs und pH ableitet, erklärt die Einheit Ladung und pH-Wert.
| Gruppe | Beispiel | pKs etwa | Zustand bei pH 7 |
|---|---|---|---|
| Carbonsäure | Benzoesäure | 4,2 | Anion |
| Aliphatisches Amin | Benzylamin | 9,3 | Kation |
| Aromatisches Amin | Anilin | 4,6 | neutral |
| Phenol | Chlorphenole | 8,5 bis 9,4 | überwiegend neutral, im Alkalischen Anion |
| Alkohol, Ester, Arylhalogenid | Benzylalkohol, Methylchlorbenzoat, Dichlorbenzol | nicht ionisierbar | neutral |
Typen trennbarer Paare
- Homologe Ionen: 2-Methyl- und 2-Ethylbenzoesäure wandern als Anionen, 2-Methyl- und 2-Ethylbenzylamin als Kationen. Die Ladung ist gleich, aber das größere Ethylhomologe wandert langsamer.
- Stellungsisomere: 2- und 4-Chlorbenzoesäure sowie 2-, 3- und 4-Chlorphenol. Die Lage des Chlors verschiebt den pKs-Wert und damit den Dissoziationsgrad. Chlorphenole brauchen dafür einen alkalischen Puffer.
- Unterschiedliche Ladung: Benzoesäure ist einfach, Phthalsäure zweifach negativ. Benzoesäure als Anion und Benzylamin als Kation wandern sogar entgegengesetzt.
- Neutralstoff und Ion: Benzylalkohol lässt sich von Benzoesäure und von Benzylamin trennen. Das Ion hat eine eigene Mobilität, der Neutralstoff läuft nur mit dem EOF.
Auch Aminosäuren folgen dieser Logik. Phenylalanin und Tyrosin sind prinzipiell trennbar, denn die phenolische OH-Gruppe des Tyrosins wird im Alkalischen zusätzlich deprotoniert. Amphetamin und Tyrosin trennen sich bei pH > 9. Tyrosin ist dort Anion, Amphetamin (pKs ≈ 9,9) noch teilweise Kation.
Anilin ist eine sehr schwache Base und liegt bei pH 7 ungeladen vor. Von Benzylamin ist es trotzdem trennbar, weil Benzylamin als Kation wandert.
Trennbarkeit aus der Strukturformel
- Gruppe finden: Ionisierbare Gruppen markieren, also Carbonsäure, Amin oder Phenol.
- Ladung bestimmen: pKs mit dem Puffer-pH vergleichen und die Ladung beider Partner festlegen.
- Urteilen: Ist mindestens ein Partner geladen, sind die Analyte trennbar. Sind beide neutral, wandern sie gemeinsam.
- Enantiomere prüfen: Spiegelbilder haben gleiche Ladung und Größe. Sie brauchen einen chiralen Selektor.
Die Trennbarkeit von Paaren aus Strukturformeln ist ein Examensklassiker. Achte auf die ionisierbare Gruppe: Homologe, Stellungsisomere und Paare mit verschiedener Ladung sind trennbar, sobald mindestens ein Partner geladen ist.
Grenzen bei Neutralstoffen
Neutralstoffe haben keine eigene elektrophoretische Mobilität. Der elektroosmotische Fluss nimmt sie nur mit. Alle erreichen den Detektor gleichzeitig und erscheinen als ein gemeinsamer Peak beim EOF. Die Ionen trennen sich davor und dahinter.
Das gilt in reinem wässrigem Puffer, egal wie verschieden die Moleküle sonst gebaut sind. Nicht trennbar sind zum Beispiel:
- Stellungsisomere ohne ionisierbare Gruppe wie 1,2- und 1,4-Dichlorbenzol oder Methyl-2- und Methyl-4-chlorbenzoat
- homologe Alkohole wie 2-Methyl- und 2-Ethylbenzylalkohol
- Steroide wie Hydrocortison und Hydrocortisonacetat oder Cholesterol und Progesteron
- Parabene bei pH 3, weil ihre phenolische Gruppe dort protoniert bleibt
- ungeladene Polymere wie Polyethylenglycol
Oft entscheidet eine einzige Gruppe. Wird die Säure zum Methylester, entsteht ein Neutralstoff. Ersetzt OH die Aminogruppe, wird aus dem Kation ein neutraler Alkohol.
Neutralstoffe lassen sich erst trennen, wenn der Puffer einen Micellbildner wie SDS enthält. Dann verteilen sie sich zwischen Puffer und Micellen. Dieses Verfahren ist die MEKC.
Quiz
Aussage 1
Bei der trägerfreien Elektrophorese wandern die Ionen durch ein Gel, das zusätzlich nach Größe siebt.
Trägerfrei heißt Trennung in reiner Pufferlösung. Gel oder Papier gehören zur Trägerelektrophorese.
Aussage 2
Anilin liegt in Phosphatpuffer bei pH 7 überwiegend als Kation vor.
Anilin ist eine sehr schwache Base und bei pH 7 neutral. Von Benzylamin ist es trotzdem trennbar, weil Benzylamin als Kation wandert.
Aussage 3
Benzylalkohol und Benzoesäure sind in Phosphatpuffer durch CZE trennbar.
Benzoesäure liegt als Anion vor und hat eine eigene Mobilität, Benzylalkohol läuft als Neutralstoff nur mit dem EOF.
Aussage 4
Benzoesäure und Phthalsäure lassen sich in der CZE trennen, weil Phthalsäure bei pH 7 zweifach negativ geladen ist.
Die unterschiedliche Ladung (einfach gegenüber zweifach negativ) führt zu unterschiedlicher Mobilität.
Aussage 5
Parabene werden in der CZE bei pH 3 nicht voneinander getrennt, weil sie dort ungeladen vorliegen.
Die phenolische Gruppe bleibt bei pH 3 protoniert. Ohne Ladung wandern alle Parabene gemeinsam mit dem EOF.
Aussage 6
Methyl-2-chlorbenzoat und Methyl-4-chlorbenzoat lassen sich in der CZE in reinem Phosphatpuffer trennen.
Beide Ester sind Neutralstoffe ohne ionisierbare Gruppe. Sie wandern gemeinsam mit dem EOF und werden nicht getrennt.
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