Gelelektrophorese und SDS-PAGE
Wie Gele als Träger Makromoleküle nach ihrer Größe trennen und wie die SDS-PAGE Proteine nach Molekülmasse sortiert und sichtbar macht.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Gelelektrophorese ist eine Trägerelektrophorese, bei der Makromoleküle in einem porösen Gel wandern und sich über den Molekularsiebeffekt nach Größe trennen.
- Träger sind Agarose, Polyacrylamid, Celluloseacetat-Folie und Papier; die Porengröße von Agarosegelen steuert die Agarosekonzentration.
- Bisacrylamid vernetzt die Polyacrylamidketten zum Gel, SDS denaturiert die Proteine, Mercaptoethanol spaltet Disulfidbrücken.
- In der SDS-PAGE tragen alle Protein-SDS-Komplexe dieselbe Ladung pro Masse, wandern zur Anode und trennen sich nach Kettenlänge; Fragmente laufen weiter als das intakte Protein.
- Die relative Molekülmasse liest man an einer Geraden lg M gegen \(R_f\) aus Markerproteinen ab.
- Nach Coomassie-Färbung und Entfärben erscheinen Proteine als blaue Banden auf farblosem Hintergrund.
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Worum es geht
Die Gelelektrophorese trennt Proteine und Nukleinsäuren in einem porösen Träger nach ihrer Größe. In der Pharmazie prüft man so etwa Identität und Reinheit von Proteinarzneistoffen wie Insulin oder monoklonalen Antikörpern.
Trägerelektrophorese
Bei jeder Elektrophorese wandern geladene Teilchen im elektrischen Feld. Ihre Geschwindigkeit hängt von Ladung und Größe ab, wie unter Elektrophoretische Mobilität gezeigt. Bei der Trägerelektrophorese läuft diese Wanderung in einem mit Elektrolyt getränkten Trägermaterial ab. Der Träger bremst Konvektion und Diffusion, sodass getrennte Zonen an ihrem Platz bleiben.
Die Gelelektrophorese ist das wichtigste Trägerverfahren für Makromoleküle. Hier ist der Träger mehr als eine Unterlage: Seine Poren bremsen große Moleküle stärker als kleine. Das Gegenstück ist die trägerfreie Trennung in der Kapillarzonenelektrophorese.
Trägermaterialien und Agarose
Als Träger dienen Gele, Folien und Papier. Papier ist der klassische Träger der Niederspannungs-Elektrophorese. Celluloseacetat-Folien nutzt man etwa für die Serumelektrophorese. Für Makromoleküle setzt man vor allem Gele aus Agarose oder Polyacrylamid ein. SDS gehört nicht in diese Reihe, denn es ist ein Zusatz zur Probe und zum Laufpuffer.
Agarose ist ein Polysaccharid und der Hauptbestandteil von Agar. Eine heiße Lösung erstarrt beim Abkühlen zu einem großporigen Gel. Die Porengröße steuert man über die Agarosekonzentration: Je mehr Agarose, desto engmaschiger das Gel. Agarosegele trennen vor allem größere DNA-Fragmente, eignen sich aber ebenso für Proteine.
Polyacrylamidgel
Polyacrylamidgele entstehen durch radikalische Polymerisation von Acrylamid zu langen Ketten. Erst N,N’-Methylenbisacrylamid, kurz Bisacrylamid, macht daraus ein Gel. Es trägt zwei polymerisierbare Doppelbindungen und baut sich so in zwei Ketten zugleich ein. Ein solcher Vernetzer (cross-linker) verknüpft die Ketten zu einem dreidimensionalen Netz. Mit den Proteinen reagiert Bisacrylamid nicht, es liefert nur das Gerüst.
Die PAGE (Polyacrylamidgel-Elektrophorese) trennt Peptide, Proteine und DNA-Fragmente vorwiegend über den Molekularsiebeffekt.
Trennung nach Molekülgröße in einem porösen Gel: Kleine Moleküle gleiten leicht durch die Maschen, große werden stärker gebremst. In engporigen Gelen trägt die Reibung an der Gelmatrix zur Trennung bei.
Adsorption am Gel und ionische Wechselwirkungen mit der Matrix sind dagegen Nebeneffekte, denn Polyacrylamid ist neutral und hydrophil. Anders als in der Gelpermeationschromatographie wandern hier die kleinen Moleküle am weitesten. Voraussetzung für jede Wanderung bleibt eine Ladung. Ungeladene Polymere wie Polyethylenglykole trennt man deshalb nicht gelelektrophoretisch.
SDS
Natriumdodecylsulfat (SDS, \(\ce{CH3(CH2)11OSO3^- Na+}\)) ist ein anionisches Tensid mit unverzweigter C12-Kette. Es besitzt kein Stereozentrum und ist daher nicht optisch aktiv. Zu Tensiden allgemein siehe Tensidtitration. In der Gelelektrophorese denaturiert SDS die Proteine. Die Alkylketten lagern sich an hydrophobe Bereiche, die Faltung bricht auf, und die Kette wird dicht mit negativ geladenen Kopfgruppen besetzt.
Disulfidbrücken übersteht diese Behandlung. Sie spaltet erst ein Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol, das man der Probe zusätzlich zusetzt.
Vernetzer: verknüpft Polyacrylamidketten zum Gel.
Denaturiert Proteine und belädt sie einheitlich negativ.
Reduziert Disulfidbrücken zu Thiolgruppen.
Den pH-Wert hält ein eigenes Puffersystem konstant, etwa Tris-Glycin. Als EOF-Marker braucht man einen ungeladenen Stoff, daher eignen sich SDS und Bisacrylamid dafür nicht. Bei 280 nm absorbiert SDS kaum, weil ihm ein aromatischer Chromophor fehlt.
Prinzip der SDS-PAGE
Die SDS-PAGE ist eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese denaturierter Proteine. Man erhitzt die Proben mit SDS und Reduktionsmittel und füllt sie in Taschen an der Kathode. Proteine binden SDS in nahezu konstantem Massenverhältnis, etwa 1,4 g SDS je Gramm Protein. Diese negative Ladung überdeckt die Eigenladung. Alle Protein-SDS-Komplexe wandern daher zur Anode.
Weil das Verhältnis von Ladung zu Masse überall gleich ist, entscheidet nur der Molekularsiebeffekt. Die Proteine trennen sich nach Kettenlänge und damit nach Molekülmasse. Saure oder basische Seitenketten beeinflussen die Wanderung kaum. Auch die Tertiärstruktur spielt keine Rolle, denn sie ist zerstört.
Je kleiner die Kette, desto weiter wandert sie zur Anode. Ein Proteinfragment erscheint deshalb unterhalb der Bande des intakten Proteins.
Zur Bestimmung der relativen Molekülmasse laufen Markerproteine bekannter Masse in einer eigenen Spur mit. Für jede Bande teilt man ihre Laufstrecke durch die der Farbstofffront und erhält \(R_f\). Trägt man \(\lg M\) gegen \(R_f\) auf, ergibt sich eine fallende Gerade. Am \(R_f\)-Wert des unbekannten Proteins liest man seine Masse ab.
Ein natives Protein läuft in der Regel anders als dasselbe Protein denaturiert, weil dann Faltung und Eigenladung mitbestimmen. Faltungsformen unterscheidet man deshalb mit nativer PAGE. In der kontinuierlichen SDS-PAGE haben Gel und Laufpuffer denselben pH-Wert. Ein Sammelgel mit abweichendem pH gehört zur Disk-Elektrophorese. Stärke und Cellulose trennt die SDS-PAGE nicht, da diese neutralen Polysaccharide kein SDS binden.
Färbung von Proteinbanden
Proteine sind im Gel unsichtbar und werden nach dem Lauf mit Farbstoffen angefärbt. Standard ist Coomassie-Blau in saurer, alkoholischer Lösung, die die Proteine zugleich im Gel fixiert. Anschließend entfärbt man in Essigsäure-Methanol-Lösung. Der ungebundene Farbstoff verlässt das Gel, der an Protein gebundene bleibt. Übrig bleiben blaue Banden auf weitgehend farblosem Hintergrund.
Die Detektion ist nicht an einen bestimmten Ladungstyp des Farbstoffs gebunden. Neben Coomassie eignen sich etwa die empfindlichere Silberfärbung oder Fluoreszenzfarbstoffe.
Quiz
Aussage 1
Ein proteolytisches Spaltfragment legt in der SDS-PAGE eine kürzere Strecke zurück als das intakte Protein.
Kleinere Ketten werden vom Gel weniger gebremst. Fragmente wandern daher weiter als das intakte Protein.
Aussage 2
Je höher die Agarosekonzentration eines Gels, desto kleiner sind seine Poren.
Die Agarosekonzentration bestimmt die Porengröße, mehr Agarose ergibt ein engmaschigeres Gel.
Aussage 3
Disulfidbrücken der Proteine werden in der SDS-PAGE durch das SDS selbst gespalten.
SDS denaturiert nur. Disulfidbrücken spaltet ein zugesetztes Reduktionsmittel wie 2-Mercaptoethanol.
Aussage 4
Bei der SDS-PAGE wandern die Protein-SDS-Komplexe zur Anode.
Die gebundenen Dodecylsulfat-Anionen machen alle Komplexe stark negativ, daher wandern sie zum Pluspol.
Aussage 5
Nach Coomassie-Färbung und anschließendem Entfärben erscheinen die Proteinbanden blau auf weitgehend farblosem Hintergrund.
Beim Entfärben verlässt ungebundener Farbstoff das Gel, an Protein gebundenes Coomassie-Blau bleibt zurück.
Aussage 6
Die Trennung von Proteinen in der PAGE beruht vorwiegend auf ihrer Adsorption an der Polyacrylamidmatrix.
Vorwiegend wirkt der Molekularsiebeffekt, also die Trennung nach Molekülgröße. Adsorption ist nur ein Nebeneffekt.
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