Trennprinzip und Kenngrößen der Ausschlusschromatographie
Wie die Ausschlusschromatographie Moleküle nach ihrer Größe trennt, was Ausschlussvolumen und Permeationsgrenze bedeuten und warum große Moleküle zuerst eluieren.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist eine Säulenchromatographie an porösen Partikeln, die Moleküle allein nach ihrer Größe in Lösung trennt.
- Sie beruht auf dem inversen Siebeffekt: Kleine Moleküle erreichen mehr Porenraum und werden länger zurückgehalten, große werden ausgeschlossen und eluieren zuerst.
- Das Ausschlussvolumen \(V_0\) ist das Zwischenkornvolumen; dort eluieren Moleküle, die deutlich größer als die Poren sind.
- Unterhalb der Permeationsgrenze dringen Moleküle vollständig in die Poren ein und eluieren gemeinsam beim Permeationsvolumen \(V_t = V_0 + V_i\).
- Die Retentionszeit sinkt mit zunehmender Molekülgröße, das Elutionsvolumen ist aber nicht direkt proportional zur relativen Molekülmasse.
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Worum es geht
Die Ausschlusschromatographie trennt Moleküle allein nach ihrer Größe in Lösung und nicht nach ihrer Polarität. In der Pharmazie nutzt man sie für Proteine, Peptide und Polymere, etwa um Aggregate eines biotechnologischen Arzneistoffs zu erkennen oder Molekülmassen abzuschätzen.
Aufbau und Durchführung
Die Ausschlusschromatographie ist eine Form der Säulenchromatographie. Eine mobile Phase strömt durch eine gepackte Säule, wie bei allen chromatographischen Trennprinzipien. Die Besonderheit steckt in der Packung. Sie besteht aus porösen Partikeln mit definierter Porenweite.
Typische Trägermaterialien sind quervernetzte Gele aus Dextran, Agarose oder Polyacrylamid. Dazu kommen Styrol-Divinylbenzol-Copolymere und poröses Kieselgel. Sie sollen mit den Probenmolekülen möglichst nicht wechselwirken. Die Porenweite legt fest, welchen Größenbereich eine Säule trennen kann.
Die mobile Phase richtet sich nach der Probe. Für Proteine und andere wasserlösliche Biopolymere nimmt man wässrige Puffer. Das Verfahren heißt dann auch Gelfiltration. Synthetische Polymere trennt man in organischen Fließmitteln wie Tetrahydrofuran. Dann spricht man von Gelpermeationschromatographie (GPC). Das Fließmittel soll die Probe nur lösen und Wechselwirkungen unterdrücken.
Apparativ gleicht eine SEC-Anlage einer HPLC. Eine Pumpe fördert das Fließmittel, ein Injektor gibt die Probe auf. Hinter der Säule misst meist ein UV- oder Brechungsindexdetektor (Detektionsverfahren). Man arbeitet isokratisch, denn die Trennung beruht nicht auf der Elutionskraft des Fließmittels.
Trennprinzip
Die Größenausschlusschromatographie, kurz SEC (size exclusion chromatography), trennt Moleküle nach ihrer Größe. Die Molekülgröße bestimmt das chromatographische Verhalten eines Stoffes. Entscheidend ist, wie viel Porenraum ein Molekül erreicht. Kleine Moleküle diffundieren in fast alle Poren. Mittelgroße erreichen nur die weiten Poren. Sehr große passen in keine Pore und bleiben zwischen den Partikeln.
Daraus folgt ihr Weg durch die Säule. Ein kleines Molekül hält sich oft in den Poren auf und wird dort nicht vom Strom mitgenommen. Es legt effektiv das größte Volumen zurück und kommt zuletzt. Große Moleküle strömen am Porenraum vorbei und erscheinen zuerst. Man kann sich die Poren wie Nebenstraßen vorstellen: Wer hineinpasst, macht Umwege.
Bei einem Sieb bleiben die großen Teilchen zurück. In der SEC ist es umgekehrt: Kleine Moleküle werden zurückgehalten, große wandern am schnellsten durch die Säule.
Mit einer Filtration hat das nichts zu tun. Große Moleküle werden nicht an den Partikeln festgehalten, sie umströmen sie ungehindert. Die Trennung entsteht allein durch die unterschiedliche Zugänglichkeit der Poren. Chemische Wechselwirkungen sind idealerweise ausgeschaltet.
Wird im Examen gerne gefragt: Die SEC trennt nach Molekülgröße über einen inversen Siebeffekt. Achte darauf, dass große Moleküle zuerst eluieren, weil sie von den Poren ausgeschlossen sind, und nicht durch einen Filtereffekt stärker festgehalten werden.
Ausschlussvolumen und Permeationsgrenze
Zwei Volumina begrenzen jede Größentrennung. Das Ausschlussvolumen \(V_0\) ist das Flüssigkeitsvolumen zwischen den Partikeln, also das Zwischenkornvolumen. Moleküle, die deutlich größer als die Poren sind, eluieren genau hier. Die zugehörige Zeit heißt Ausschlusszeit \(t_0\).
Das andere Ende markiert das Permeationsvolumen \(V_t\). Es umfasst das Zwischenkornvolumen und das gesamte Porenvolumen \(V_i\), also \(V_t = V_0 + V_i\). Kleine Moleküle, die alle Poren erreichen, eluieren erst bei \(V_t\). Es entspricht der gesamten mobilen Phase in der Säule. Die zugehörige Zeit ist die Mobile-Phase-Zeit \(t_M\) (siehe Retentionszeiten).
In der SEC nennt man das Ausschlussvolumen \(V_0\) oft auch Totvolumen. Vollständig permeierende Substanzen eluieren deshalb nicht mit dem Totvolumen, sondern erst beim Permeationsvolumen \(V_t\).
Die Permeationsgrenze ist die Molekülgröße, unterhalb derer Moleküle vollständig in die Poren eindringen. Alle noch kleineren Stoffe erscheinen gemeinsam bei \(V_t\) und werden nicht getrennt. Spiegelbildlich markiert die Ausschlussgrenze die Größe, oberhalb derer alles gemeinsam bei \(V_0\) eluiert.
Nur dazwischen liegt der Trennbereich. Hier dringen Moleküle teilweise in die Poren ein und eluieren zwischen \(V_0\) und \(V_t\). Den erreichbaren Anteil des Porenraums beschreibt der Verteilungskoeffizient \(K_D = (V_e - V_0)/(V_t - V_0)\) mit dem Elutionsvolumen \(V_e\). Er liegt zwischen 0 für ausgeschlossene und 1 für vollständig permeierende Moleküle.
Das hilft beim Deuten eines Chromatogramms. Hydrolysiert man ein Protein, laufen die abgespaltenen freien Aminosäuren nahe \(V_t\). Ein Peak kurz nach \(V_0\) enthält dagegen große Moleküle, etwa unverändertes Protein oder Aggregate.
Elutionsreihenfolge
Aus dem Trennprinzip folgt die Regel: Große Moleküle eluieren zuerst, kleine zuletzt. Die Retentionszeit nimmt mit zunehmender Molekülgröße ab. Von zwei Komponenten wird die mit größerer Molekülmasse also in der Regel rascher eluiert.
Das „in der Regel“ hat Gründe. Die Säule spürt die räumliche Ausdehnung in Lösung, nicht die Masse. Ein langgestrecktes Molekül wirkt größer als ein kompaktes, kugelförmiges gleicher Masse und eluiert früher. Auch Restwechselwirkungen mit dem Gel, etwa Adsorption aromatischer Stoffe, können ein Molekül länger zurückhalten. Für ähnlich gebaute Stoffe gilt die Regel aber zuverlässig.
Auch quantitativ ist der Zusammenhang nicht einfach. Das Elutionsvolumen ist nicht direkt proportional zur relativen Molekülmasse. Im Trennbereich hängt es näherungsweise linear vom Logarithmus der Molekülmasse ab. Wie man daraus mit Standards Molekülmassen bestimmt, zeigt die Einheit Molekülmassenbestimmung und Trennung von Makromolekülen.
Quiz
Aussage 1
Moleküle unterhalb der Permeationsgrenze dringen vollständig in die Poren ein und werden untereinander nicht mehr nach Größe getrennt.
Sie erreichen den gesamten Porenraum und eluieren gemeinsam beim Permeationsvolumen \(V_t\).
Aussage 2
Große Moleküle werden in der SEC durch einen Filtereffekt an der stationären Phase stärker festgehalten als kleine.
Große Moleküle umströmen die Partikel ungehindert und eluieren zuerst. Die Trennung beruht auf der Zugänglichkeit der Poren (inverser Siebeffekt), nicht auf Filtration.
Aussage 3
Nach der Hydrolyse eines Proteins findet man die freien Aminosäuren in einem Peak nahe dem Ausschlussvolumen.
Freie Aminosäuren sind klein, dringen in alle Poren ein und eluieren nahe dem Permeationsvolumen \(V_t\). Nahe \(V_0\) eluieren große Moleküle.
Aussage 4
Das Ausschlussvolumen \(V_0\) entspricht dem Flüssigkeitsvolumen zwischen den Partikeln des Trägermaterials.
\(V_0\) ist das Zwischenkornvolumen. Moleküle, die in keine Pore passen, eluieren genau dort.
Aussage 5
Verdoppelt sich die relative Molekülmasse eines Stoffes, verdoppelt sich in der SEC auch sein Elutionsvolumen.
Das Elutionsvolumen ist nicht direkt proportional zur relativen Molekülmasse. Größere Moleküle eluieren sogar früher, im Trennbereich etwa linear zum Logarithmus der Molekülmasse.
Aussage 6
In der SEC erreichen kleine Moleküle mehr Porenvolumen als große und eluieren deshalb später.
Kleine Moleküle diffundieren in fast alle Poren, legen effektiv das größte Volumen zurück und erscheinen zuletzt.
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