Headspace-GC und pharmazeutische Anwendungen der GC
Wann die Gaschromatographie das passende Verfahren ist, wie die Headspace-GC den Gasraum über einer Probe nutzt und wie man damit Restlösungsmittel, Blutalkohol oder Restmonomere bestimmt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Headspace-GC injiziert nach Einstellung eines Verteilungsgleichgewichts nur den Dampfraum über einer Probe in den Gaschromatographen.
- Die GC ist das Verfahren der Wahl für flüchtige, ungeladene, niedermolekulare Analyten, etwa Cyclohexan und Cyclohexanon mit Helium als mobiler Phase.
- Die Konzentration im Dampfraum hängt vom Gehalt in der Probe ab, die Vialtemperatur verschiebt das Verteilungsverhältnis.
- Weil nur Gas injiziert wird, sind Matrixeffekte minimiert, die Gasphase spiegelt aber nicht die Gesamtzusammensetzung der Probe wider.
- Ethanol im Blut bestimmt man per Headspace-GC, AAS und ICP-AES bestimmen nur Elemente; Schwermetalle wie Platin und Palladium sind per Headspace-GC nicht bestimmbar.
- Bei Acrylsäuremethylester mit Propan-1-ol als internem Standard sind nur diese beiden Peaks auswertungsrelevant, Wasser gibt im FID kein Signal.
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Worum es geht
Die Gaschromatographie trennt flüchtige Stoffe und gehört zu den Standardmethoden des Arzneibuchs. Mit der Headspace-Technik analysiert man nur den Gasraum über einer Probe. So bestimmt man etwa Restlösungsmittel in Wirkstoffen oder Ethanol im Blut, ohne die Probe vorher aufzuarbeiten.
GC im Arzneibuch
Das Arzneibuch setzt die GC in drei Bereichen ein. Bei der Identitätsprüfung vergleicht man die Retentionszeit mit der einer Referenzsubstanz. Bei der Reinheitsprüfung sucht man flüchtige Verunreinigungen. Bei der Gehaltsbestimmung quantifiziert man über die Peakfläche. Wie Trägergas, Injektor und Säule zusammenspielen, erklärt die Einheit zu Prinzip und Geräteaufbau der GC.
Der typische Einsatz ist die Restlösungsmittelprüfung. Aus der Synthese bleiben oft Spuren von Methanol, Ethanol, Aceton oder Dichlormethan im Wirkstoff zurück. Diese Stoffe sind flüchtig und lassen sich deshalb gut gaschromatographisch erfassen.
Für die Probenaufgabe gibt es zwei Wege. Bei der direkten Injektion spritzt man die gelöste Probe in den heißen Injektor. Dort verdampft alles, was verdampfen kann. Bei der Headspace-Technik bleibt die Probe im verschlossenen Gefäß, und nur der Gasraum darüber gelangt ins Gerät.
Methodenwahl
Die GC ist das Verfahren der Wahl, wenn die Analyten flüchtig, ungeladen und niedermolekular sind. Außerdem müssen sie bei der Arbeitstemperatur stabil bleiben. Salze, Ionen und große polare Moleküle verdampfen nicht unzersetzt. Für sie wählt man die HPLC, oder man macht sie durch Derivatisierung flüchtig.
Ein Beispiel ist das Gemisch aus Cyclohexan und Cyclohexanon. Beide sind kleine, neutrale Moleküle. Cyclohexan siedet bei etwa 81 °C, Cyclohexanon bei etwa 156 °C. Alle drei Kriterien sind also erfüllt. Man trennt das Paar am besten gaschromatographisch mit Helium als mobiler Phase. Das höher siedende und polarere Keton erscheint dabei später.
Prinzip der Headspace-GC
Für die Headspace-GC füllt man die Probe in ein Vial und verschließt es gasdicht mit einem Septum. Das Vial wird thermostatiert. Flüchtige Moleküle wechseln ständig zwischen Probe und Gasraum hin und her. Nach einiger Zeit stellt sich ein thermodynamisches Verteilungsgleichgewicht ein. Erst dann entnimmt man Gas. Die allgemeinen Grundlagen solcher Gleichgewichte stehen unter Chromatographische Trennprinzipien.
Der Dampfraum ist der Gasraum über einer flüssigen oder festen Probe in einem verschlossenen Gefäß. Die Headspace-GC injiziert einen Teil dieses Dampfraums nach Einstellung des Gleichgewichts in den Gaschromatographen.
Im Gleichgewicht hängt die Konzentration eines Stoffes im Dampfraum von seinem Gehalt in der Probe ab. Mehr Analyt in der Probe bedeutet mehr Analyt im Gas. Darauf beruht die Quantifizierung. Die Vialtemperatur verschiebt das Verteilungsverhältnis zwischen Flüssigkeit und Gasphase. Bei höherer Temperatur gehen meist mehr Moleküle in den Dampfraum, das Signal wächst. Proben und Kalibrierlösungen äquilibriert man deshalb bei gleicher Temperatur und gleicher Zeit.
Injiziert wird nur die Gasphase. Nichtflüchtige Bestandteile wie Salze, Proteine oder der Arzneistoff selbst bleiben im Vial. Sie verschmutzen weder Injektor noch Säule und stören die Trennung nicht. So werden Matrixeffekte minimiert. Man kann sich das wie den Duft über einer Teetasse vorstellen: Man riecht das Aroma, ohne die Blätter mitzutrinken.
Der Preis dafür: Die injizierte Gasphase gibt nicht die Gesamtzusammensetzung der Probe wieder. Nichtflüchtiges fehlt ganz. Zudem reichert sich jeder flüchtige Stoff nach seinem eigenen Verteilungskoeffizienten an. Hexan entweicht aus Wasser bevorzugt in den Dampfraum. Ethanol bleibt über Wasserstoffbrücken großteils gelöst.
Gleiche Gehalte in der Probe ergeben im Headspace-Chromatogramm meist ungleich große Peaks. Quantifizieren kann man deshalb nur über eine Kalibrierung unter identischen Bedingungen, am besten in gleicher Matrix oder mit internem Standard.
Einsatzbereich
Die Headspace-GC eignet sich besonders für leicht flüchtige Komponenten. Sie bestimmt diese in Gemischen qualitativ und quantitativ, und zwar ohne vorherige Aufarbeitung. Extraktion oder Filtration entfallen, weil die Matrix ohnehin im Vial bleibt. Das funktioniert für Flüssigkeiten ebenso wie für Feststoffe.
- wässrige Proben wie Blut oder Injektionslösungen
- Pulver, etwa Wirkstoffe mit Restlösungsmitteln
- Gemische leicht flüchtiger organischer Stoffe
- Schwermetalle wie Platin und Palladium
- Salze und Ionen
- nichtflüchtige Arznei- und Hilfsstoffe
Entscheidend ist der Dampfdruck. Platin und Palladium bleiben als Katalysatorreste im Wirkstoff zurück, gelangen aber nie in den Dampfraum. Für sie braucht man Verfahren der Elementanalytik.
Anwendungsbeispiele
Ethanol im Blut wird quantitativ mittels Headspace-GC bestimmt. Ethanol ist klein, flüchtig und ungeladen. Blutzellen, Proteine und Salze bleiben im Vial und belasten das Gerät nicht. Die Atomabsorptionsspektroskopie und die ICP-Atomemissionsspektroskopie eignen sich dafür nicht. Sie bestimmen Elemente, keine organischen Moleküle. Ein Ethanolmolekül ließe sich damit nicht als solches erfassen.
Acrylsäuremethylester mit internem Standard
In einer wässrigen Arzneistofflösung soll Acrylsäuremethylester als Restmonomer bestimmt werden. Man setzt Propan-1-ol als internen Standard zu und erhitzt das Vial kurz auf 90 °C. Welche Peaks wertet man aus? Man prüft jeden Bestandteil einzeln:
- Wasser verdampft, liefert im FID aber kein Signal, weil es keine C-H-Bindungen hat.
- Der Arzneistoff ist nichtflüchtig und bleibt in der Lösung.
- Acrylsäuremethylester ist flüchtig und organisch, der FID erfasst ihn. Er ist der Analyt.
- Propan-1-ol ist flüchtig und FID-aktiv. Es dient als Bezugsgröße.
Bleibt die Frage, ob der Ester beim Erhitzen reagiert. Denkbar wären Hydrolyse und Umesterung mit Propanol zum Propylester:
\[\ce{CH2=CHCOOCH3 + H2O <=> CH2=CHCOOH + CH3OH}\]
Beim kurzen Erhitzen laufen beide Reaktionen nicht nennenswert ab. Methanol, Acrylsäure oder Propylester spielen für die Auswertung deshalb keine Rolle. Auswertungsrelevant sind nur die Peaks von Acrylsäuremethylester und Propan-1-ol. Ihr Flächenverhältnis liefert über die Kalibrierung den Gehalt.
Quiz
Aussage 1
Bei der Headspace-GC von Acrylsäuremethylester in wässriger Arzneistofflösung mit Propan-1-ol als internem Standard liefert das Wasser im FID keinen auswertbaren Peak.
Wasser hat keine C-H-Bindungen und erzeugt im FID kein Signal. Auswertungsrelevant sind nur Acrylsäuremethylester und Propan-1-ol.
Aussage 2
Eine höhere Vialtemperatur verändert das Verteilungsverhältnis eines Analyten zwischen Flüssigkeit und Gasphase.
Die Temperatur verschiebt das Gleichgewicht, meist gehen bei höherer Temperatur mehr Moleküle in den Dampfraum.
Aussage 3
Die ICP-Atomemissionsspektroskopie ist ein geeignetes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Ethanol im Blut.
ICP-AES und AAS bestimmen Elemente, keine organischen Moleküle. Ethanol im Blut bestimmt man per Headspace-GC.
Aussage 4
Bei der Headspace-GC bleiben nichtflüchtige Probenbestandteile im Vial, weil nur die Gasphase injiziert wird.
Injiziert wird ausschließlich der Dampfraum. Salze, Proteine oder Arzneistoffe bleiben in der Probe, dadurch werden Matrixeffekte minimiert.
Aussage 5
Das Verhältnis der Peakflächen im Headspace-Chromatogramm entspricht direkt dem Mengenverhältnis der Stoffe in der Probe.
Jeder Stoff reichert sich nach seinem eigenen Verteilungskoeffizienten im Dampfraum an. Die Gasphase gibt nicht die Gesamtzusammensetzung wieder, man braucht eine Kalibrierung unter gleichen Bedingungen.
Aussage 6
Palladiumreste aus der Synthese lassen sich in einem Wirkstoffpulver per Headspace-GC quantifizieren.
Schwermetalle wie Palladium und Platin haben keinen nennenswerten Dampfdruck und gelangen nicht in den Dampfraum. Dafür braucht man Verfahren der Elementanalytik.
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