Molekülmassenbestimmung und Trennung von Makromolekülen
Wie man mit der Ausschlusschromatographie über eine Kalibriergerade Molekülmassen abschätzt, Peaks von Proteinaggregaten zuordnet und Polymere wie PEG nach Kettenlänge trennt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die SEC (Gelchromatographie) dient zur näherungsweisen Molekülmassenbestimmung und zur größenabhängigen Trennung von Proteinen, Peptiden und Polymeren.
- Für homologe Verbindungen gilt im Trennbereich \(\lg M_\mathrm{r} = a - b \cdot V_\mathrm{e}\): Der Logarithmus der Molekülmasse hängt linear vom Elutionsvolumen ab, das Elutionsvolumen ist also nicht direkt proportional zur Masse.
- Eine Massenbestimmung erfordert eine Kalibrierung mit Standards ähnlicher Form; bei abweichender Molekülgestalt erhält man nur Näherungswerte.
- Im SEC-Chromatogramm eines therapeutischen Proteins eluieren Aggregate und Dimer vor dem Monomer, Fragmente und Salze danach.
- PEG 5000 und PEG 10000 trennt man am besten per SEC mit wässriger mobiler Phase; der breite Peak spiegelt die molekulare Größenverteilung wider.
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Worum es geht
Die Ausschlusschromatographie trennt Moleküle nach ihrer Größe in Lösung. Diese Einheit zeigt, was man in der Praxis damit anfängt: Molekülmassen abschätzen, Aggregate in Proteinarzneistoffen wie monoklonalen Antikörpern erkennen und Polymere wie Polyethylenglycol nach Kettenlänge auftrennen.
Molekülmassenbestimmung
Die Ausschlusschromatographie heißt auch Gelchromatographie. Warum große Moleküle zuerst eluieren, steht unter Trennprinzip und Kenngrößen der SEC. Ihre wichtigste Anwendung ist die Bestimmung der Molekülmasse großer Moleküle. Dazu gehören Proteine, Peptide, synthetische Polymere und andere große organische Verbindungen. Für die Größe solcher Stoffe ist die SEC das Verfahren der Wahl.
Kalibrierung mit Molekülmassenstandards
Die Säule liefert nur ein Elutionsvolumen \(V_\mathrm{e}\), keine Masse. Um eine Masse zu erhalten, braucht man eine Kalibrierung mit Standards (allgemein dazu: Kalibrierung und Standards). Man trennt Substanzen bekannter Molekülmasse auf derselben Säule unter gleichen Bedingungen. Für homologe Verbindungen, also Stoffe gleicher Bauart und Form, ergibt sich ein einfacher Zusammenhang. Der Logarithmus der relativen Molekülmasse fällt linear mit dem Elutionsvolumen.
\[\lg M_\mathrm{r} = a - b \cdot V_\mathrm{e}\]
\(M_\mathrm{r}\): relative Molekülmasse (ohne Einheit), \(V_\mathrm{e}\): Elutionsvolumen in mL, \(a\) und \(b\): Achsenabschnitt und Steigung aus den Standards.
Das Elutionsvolumen ist also nicht direkt proportional zur Molekülmasse. Eine doppelt so schwere Spezies eluiert nicht beim halben Volumen. Sie kommt nur um einen festen Betrag früher. Die Gerade gilt außerdem nur im Trennbereich. Am Ausschlussvolumen und an der Permeationsgrenze läuft sie flach aus. Dort lässt sich keine Masse ablesen.
In der Praxis legt man eine Ausgleichsgerade durch mehrere Standards. Das Prinzip zeigt ein Beispiel mit zwei Punkten:
- Standards messen: Ein Protein mit \(M_\mathrm{r}\) = 100 000 (\(\lg M_\mathrm{r}\) = 5,0) eluiert bei 10,0 mL, eines mit \(M_\mathrm{r}\) = 10 000 (\(\lg M_\mathrm{r}\) = 4,0) bei 15,0 mL.
- Gerade bestimmen: Die Steigung ist \(b\) = 1,0 / 5,0 mL = 0,20 pro mL. Daraus folgt \(a\) = 5,0 + 0,20 · 10,0 = 7,0.
- Analyt einsetzen: Bei \(V_\mathrm{e}\) = 12,0 mL gilt \(\lg M_\mathrm{r}\) = 7,0 − 0,20 · 12,0 = 4,6.
- Entlogarithmieren: \(M_\mathrm{r}\) = \(10^{4,6}\) ≈ 40 000.
Warum nur näherungsweise
Die SEC erfasst eigentlich die Größe des Moleküls in Lösung. Die Masse folgt daraus nur, wenn Analyt und Standards dieselbe Form haben. Ein langgestrecktes Molekül wirkt größer als ein kugeliges gleicher Masse und eluiert früher. Für Proteine und Peptide erhält man daher nur Näherungswerte. Bei Polymeren bestimmt man so die relative Molekülmasse, bezogen auf Standards ähnlicher Bauart. Genauere Massen liefert die Massenspektrometrie. Für denaturierte Proteine ist die SDS-PAGE eine Alternative.
Proteine und Aggregate
Weil die SEC nach Größe trennt, lassen sich Proteine unterschiedlicher Molekülmasse voneinander trennen. Sie arbeitet mit wässrigen Puffern und ohne denaturierende Zusätze. Die Proteine bleiben dabei nativ. Deshalb nutzt man sie in der Qualitätskontrolle therapeutischer Proteine wie monoklonaler Antikörper.
Dort sucht man vor allem Aggregate. Das sind Zusammenlagerungen aus zwei oder mehr Monomeren. Sie sind größer als das Monomer und eluieren deshalb vor dem Monomer. Aggregate können Immunreaktionen auslösen, ihr Anteil muss daher klein bleiben.
Peaks zuordnen
Bei der Deutung eines Chromatogramms geht man vom bekannten Hauptpeak aus. Bei einem therapeutischen Protein ist das das Monomer. Alles, was davor eluiert, ist größer. Alles, was danach eluiert, ist kleiner. So ergibt sich diese Zuordnung:
| Lage im Chromatogramm | Spezies | Begründung |
|---|---|---|
| ganz früh, im Ausschlussvolumen | hochmolekulare Aggregate | zu groß für alle Poren |
| kurz vor dem Hauptpeak | Dimer | etwa doppelte Größe |
| Hauptpeak | Monomer | eigentlicher Wirkstoff |
| nach dem Hauptpeak | Fragmente | kleiner als das Monomer |
| ganz am Ende | Salze, Pufferbestandteile | dringen in alle Poren ein |
Ein Peak im Ausschlussvolumen sagt nur, dass die Spezies größer als die Ausschlussgrenze ist. Ihre Masse lässt sich dort nicht bestimmen, weil die Kalibriergerade an diesem Ende flach ausläuft.
Polymere
Polyethylenglycole (PEG) sind lineare Ketten aus \(\ce{-CH2-CH2-O-}\)-Einheiten. PEG 5000 und PEG 10000 unterscheiden sich nur in der Kettenlänge. Ihre funktionellen Gruppen sind gleich. Verfahren, die nach Polarität oder Flüchtigkeit trennen, finden hier kaum einen Ansatzpunkt. Die Größe dagegen unterscheidet sich deutlich. PEG verschiedener Molekülmasse trennt man deshalb am besten durch Größenausschlusschromatographie.
PEG ist gut wasserlöslich. Man arbeitet daher mit wässriger mobiler Phase an einem hydrophilen Gel. Das längere PEG 10000 ist größer und eluiert vor PEG 5000. PEG besitzt kein Chromophor. Man detektiert es deshalb meist mit dem Brechungsindexdetektor (RI).
Molekulare Größenverteilung
Anders als ein Protein besteht eine PEG-Probe nicht aus identischen Molekülen. Die Zahl im Namen ist ein Mittelwert, die Probe enthält Ketten verschiedener Länge. Jedes PEG erscheint daher als breiter Peak. Man kann sich den Peak wie ein Histogramm der Kettenlängen vorstellen, das die Säule auseinanderzieht.
Die Verteilung der Molekülgrößen und damit der Molekülmassen in einer Polymerprobe. In der SEC entspricht über die Kalibriergerade jedem Elutionsvolumen im Peak eine bestimmte Masse.
Aus der Verteilung berechnet man Mittelwerte. Das Zahlenmittel \(M_\mathrm{n}\) gewichtet jedes Molekül gleich. Das Gewichtsmittel \(M_\mathrm{w}\) gewichtet schwere Moleküle stärker und ist daher mindestens so groß wie \(M_\mathrm{n}\). Je breiter die Verteilung, desto weiter liegen beide auseinander.
Quiz
Aussage 1
Für die Trennung von PEG 5000 und PEG 10000 ist die Größenausschlusschromatographie mit wässriger mobiler Phase die Methode der Wahl.
Beide unterscheiden sich nur in der Kettenlänge, also in der Größe; PEG ist wasserlöslich. PEG 10000 eluiert zuerst.
Aussage 2
In der SEC ist das Elutionsvolumen direkt proportional zur relativen Molekülmasse.
Der Zusammenhang ist logarithmisch: Linear ist \(\lg M_\mathrm{r}\) gegen \(V_\mathrm{e}\), nicht \(M_\mathrm{r}\) selbst.
Aussage 3
Im SEC-Chromatogramm eines monoklonalen Antikörpers erscheint der Dimer-Peak nach dem Monomer-Peak.
Das Dimer ist größer als das Monomer und eluiert deshalb vor ihm. Nach dem Monomer folgen kleinere Spezies wie Fragmente.
Aussage 4
Ein Aggregat-Peak im Ausschlussvolumen erlaubt eine besonders genaue Bestimmung der Aggregatmasse.
Am Ausschlussvolumen läuft die Kalibriergerade flach aus. Man weiß nur, dass die Spezies größer als die Ausschlussgrenze ist.
Aussage 5
Für homologe Verbindungen hängt in der SEC der Logarithmus der relativen Molekülmasse im Trennbereich linear vom Elutionsvolumen ab.
Die Kalibriergerade lautet \(\lg M_\mathrm{r} = a - b \cdot V_\mathrm{e}\) und gilt zwischen Ausschlussvolumen und Permeationsgrenze.
Aussage 6
Um aus einem Elutionsvolumen eine Molekülmasse zu ermitteln, muss die Säule zuvor mit Substanzen bekannter Molekülmasse kalibriert werden.
Die Säule liefert nur \(V_\mathrm{e}\); erst die Kalibriergerade aus Standards ordnet ihm eine Masse zu.
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