Pharmazeutische Anwendungen der Refraktometrie
Wofür das Arzneibuch die Brechzahl nutzt, welche Proben sich refraktometrisch prüfen lassen und wie der Brechungsindexdetektor in der HPLC arbeitet.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Refraktometrie nutzt die Brechzahl als Stoffkonstante zur Identitätsprüfung, Reinheitsprüfung und Gehaltsbestimmung.
- Mit dem Abbe-Refraktometer prüft man Flüssigkeiten wie Glycerol, Propan-1-ol, 2-Phenoxyethanol und Eugenol. Die feste Acetylsalicylsäure ist ungeeignet.
- Fette und Wachse misst man geschmolzen bei erhöhter Temperatur, etwa 40 °C oder 75 °C.
- Die Brechzahl wässriger Lösungen hängt nicht immer linear von der Konzentration ab. Gemische brauchen eine Kalibrierkurve.
- Glycerol 100 % und 85 % unterscheiden sich in Brechzahl, relativer Dichte und Malaprade-Gehalt. Isopropanol 90 % und 70 % trennt der Destillationsbereich nicht.
- Der RI-Detektor vergleicht Eluat und reine mobile Phase. Er eignet sich für Stoffe ohne Chromophor wie Fosfomycin-Dinatrium.
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Worum es geht
Die Brechzahl lässt sich in Sekunden und mit wenigen Tropfen Probe messen. Deshalb nutzt das Arzneibuch sie für flüssige Arznei- und Hilfsstoffe wie Glycerol oder Isopropanol. In der HPLC dient sie außerdem zum Nachweis von Stoffen, die kein UV-Licht absorbieren.
Anwendungsbereiche
Die Brechzahl ist eine Stoffkonstante. Wie sie definiert ist, steht unter Brechzahl und Totalreflexion. In der pharmazeutischen Analytik erfüllt sie drei Aufgaben:
- Identitätsprüfung: Der gemessene Wert muss im Bereich liegen, den die Monographie vorgibt.
- Reinheitsprüfung: Verunreinigungen oder Wasser verschieben die Brechzahl. Die Brechzahl dient so als Reinheitskriterium.
- Gehaltsbestimmung: Die Brechzahl einer Lösung hängt von ihrer Zusammensetzung ab. Deshalb ist die Refraktometrie auch quantitativ einsetzbar.
Alle drei Anwendungen setzen feste Messbedingungen voraus. Temperatur und Wellenlänge beeinflussen die Brechzahl, deshalb gibt das Arzneibuch meist \(n_D^{20}\) an. Die Details stehen unter Einflussgrößen der Brechzahl.
Die Refraktometrie dient zur Identitätsprüfung, zur Reinheitsprüfung und zur Gehaltsbestimmung. Das wird im Examen gerne gefragt. Achte darauf, dass die quantitative Anwendung ausdrücklich dazugehört.
Identitätsprüfung
Das Abbe-Refraktometer misst an einem dünnen Flüssigkeitsfilm zwischen zwei Prismen. Geeignet sind also Stoffe, die bei Raumtemperatur flüssig sind. Typische Beispiele sind Glycerol, Propan-1-ol, das Konservierungsmittel 2-Phenoxyethanol und Eugenol aus dem Nelkenöl.
Acetylsalicylsäure ist dagegen bei Raumtemperatur ein kristalliner Feststoff mit einem Schmelzpunkt um 135 °C. Sie lässt sich nicht mit dem Abbe-Refraktometer auf Identität prüfen.
Ob ein Stoff flüssig oder fest ist, kann man oft an der Strukturformel abschätzen. Propan-1-ol ist ein kleines Molekül mit nur einer OH-Gruppe. Glycerol bildet zwar viele Wasserstoffbrücken, ist aber flexibel und packt schlecht ins Gitter. Es bleibt eine zähe Flüssigkeit. 2-Phenoxyethanol und Eugenol tragen bewegliche Seitenketten am Aromaten. Acetylsalicylsäure hat dagegen ein starres, planares Gerüst und eine Carbonsäuregruppe, die Dimere bildet.
Starres, planares Gerüst und Carbonsäure-Dimere sprechen für einen Feststoff. Kleine oder flexible Moleküle ohne solche Packung sind meist flüssig.
Fette und Wachse sind bei 20 °C fest oder halbfest. Man misst ihre Brechzahl deshalb im geschmolzenen Zustand bei erhöhter Temperatur, etwa bei 40 °C oder 75 °C. Die Monographie nennt die jeweilige Messtemperatur.
Konzentrationsbestimmung
Unter standardisierten Bedingungen lässt sich die Konzentration einer Lösung refraktometrisch bestimmen. Temperatur und Wellenlänge müssen dabei konstant sein. Ein Beispiel ist die wässrige Glucose-Lösung: Je mehr Glucose gelöst ist, desto höher liegt die Brechzahl über der von Wasser.
Der Zusammenhang ist aber nicht immer linear. Bei Gemischen braucht man deshalb eine Kalibrierkurve aus Standards bekannter Konzentration. Die Probe wird zwischen zwei benachbarten Standards interpoliert. Wie man Kalibrierungen grundsätzlich anlegt, steht unter Kalibrierung und Standards.
Ein Rechenbeispiel mit angenommenen Werten: Ein Standard mit 10 % Glucose zeigt \(n = 1{,}3477\), einer mit 20 % zeigt \(n = 1{,}3635\). Die Probe liefert \(n = 1{,}3556\).
\[w = 10\,\% + 10\,\% \cdot \frac{1{,}3556 - 1{,}3477}{1{,}3635 - 1{,}3477} = 10\,\% + 10\,\% \cdot 0{,}5 = 15\,\%\]
Dabei ist \(w\) der Massenanteil Glucose. Die lineare Interpolation ist nur zwischen eng benachbarten Standards zulässig, weil die Kurve insgesamt leicht gekrümmt ist.
Unterscheidung von Mischungen
Wasser hat mit \(n_D^{20} = 1{,}333\) eine deutlich kleinere Brechzahl als Glycerol. Deshalb unterscheidet die Brechzahl bei 20 °C reines Glycerol sicher von Glycerol 85 %. Ebenso trennt die mit dem Pyknometer bestimmte relative Dichte beide Qualitäten. Auch die Gehaltsbestimmung durch Periodatspaltung nach Malaprade zeigt den Unterschied. Den Wassergehalt selbst kann man durch azeotrope Destillation ermitteln.
Bei Isopropanol-Wasser-Mischungen wie Isopropanol 90 % und 70 % helfen ebenfalls Brechzahl und relative Dichte. Der Destillationsbereich eignet sich dafür nicht. Wasser und Isopropanol bilden ein Azeotrop, die Siedetemperaturen verschiedener Mischungen liegen daher dicht beieinander.
| Prüfung | Glycerol 100 % gegen 85 % | Isopropanol 90 % gegen 70 % |
|---|---|---|
| Brechzahl | unterscheidet | unterscheidet |
| Relative Dichte | unterscheidet | unterscheidet |
| Malaprade-Titration | unterscheidet über den Gehalt | – |
| Destillationsbereich | – | ungeeignet |
Brechungsindexdetektor
Die Refraktometrie dient auch in der HPLC als Detektionsprinzip. Der Detektor misst laufend die Brechzahl des Eluats.
Der Brechungsindexdetektor (RI-Detektor) ist ein Differentialrefraktometer am Säulenausgang. Er registriert, wie stark sich die Brechzahl des Eluats von der reinen mobilen Phase unterscheidet.
Die Durchflusszelle ist geteilt. Durch die Messkammer fließt das Eluat, die Referenzkammer enthält reine mobile Phase. Erscheint ein Analyt, ändert sich die Brechzahl in der Messkammer. Der Lichtstrahl wird abgelenkt, und ein Fotodetektor erfasst die Verschiebung.
Der RI-Detektor erfasst jeden Stoff, dessen Brechzahl sich von der mobilen Phase unterscheidet. Er ist aber wenig empfindlich und reagiert stark auf Temperaturschwankungen. Eine Gradientenelution verändert die Brechzahl der mobilen Phase selbst, deshalb arbeitet man isokratisch. Den Vergleich mit anderen Detektoren zeigt die Seite Detektionsverfahren in der HPLC.
Seine Stärke spielt der RI-Detektor bei Stoffen ohne Chromophor aus. Ein Beispiel ist das Antibiotikum Fosfomycin-Dinatrium. Es besteht nur aus einem Epoxidring und einer Phosphonatgruppe. Ein aromatisches oder konjugiertes System fehlt, es absorbiert im UV kaum. Für Fosfomycin ist der Brechzahldetektor daher besser geeignet als ein UV/Vis-Detektor.
Quiz
Aussage 1
Für die HPLC-Detektion von Fosfomycin-Dinatrium eignet sich ein Brechungsindexdetektor besser als ein UV/Vis-Detektor.
Fosfomycin besitzt kein aromatisches oder konjugiertes System und absorbiert im UV kaum. Der RI-Detektor erfasst es über die Brechzahländerung des Eluats.
Aussage 2
Weil die Brechzahl wässriger Lösungen stets streng linear mit der Konzentration steigt, genügt für Gemische ein einziger Standard.
Der Zusammenhang ist nicht immer linear. Für Gehaltsbestimmungen von Gemischen braucht man eine Kalibrierkurve aus mehreren Standards.
Aussage 3
Acetylsalicylsäure lässt sich nicht mit dem Abbe-Refraktometer auf Identität prüfen, weil sie bei Raumtemperatur fest ist.
Das Abbe-Refraktometer misst an einem Flüssigkeitsfilm. Acetylsalicylsäure ist ein kristalliner Feststoff mit einem Schmelzpunkt um 135 °C.
Aussage 4
Die Refraktometrie ist ein rein qualitatives Verfahren und dient nur zur Identitäts- und Reinheitsprüfung.
Die Refraktometrie ist auch quantitativ einsetzbar. Sie dient zusätzlich zur Gehaltsbestimmung, etwa von Glucose-Lösungen.
Aussage 5
Isopropanol 90 % und Isopropanol 70 % lassen sich zuverlässig über den Destillationsbereich unterscheiden.
Der Destillationsbereich ist dafür ungeeignet. Beide Mischungen unterscheidet man über Brechzahl oder relative Dichte.
Aussage 6
Die Brechzahl von Wachsen wird im geschmolzenen Zustand bei erhöhter Temperatur, zum Beispiel 75 °C, bestimmt.
Fette und Wachse sind bei 20 °C fest oder halbfest. Man misst sie daher bei erhöhter Temperatur wie 40 °C oder 75 °C.
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