Integration und quantitative NMR
Wie die Fläche unter einem NMR-Signal die Zahl der Kerne verrät und wie man daraus mit einem internen Standard Gehalte berechnet.
Das Wichtigste in Kürze
- Das Integral ist die Fläche unter einem NMR-Signal und proportional zur Zahl der Kerne, die es erzeugen; die qNMR nutzt das zur Gehaltsbestimmung.
- Signalhöhe, Halbwertsbreite und chemische Verschiebung sind kein Maß für die Kernzahl; Kopplung verteilt dieselbe Fläche auf mehrere Linien.
- Bei qNMR mit internem Standard muss dessen Gehalt bekannt sein, ein Referenzmaterial des Analyten ist nicht nötig.
- Gehalt: \(m_x = m_{St} \cdot \frac{I_x}{I_{St}} \cdot \frac{N_{St}}{N_x} \cdot \frac{M_x}{M_{St}}\), etwa mit Maleinsäure (Singulett, 2 H, 6,3 ppm) als Standard.
- Bei der Normalisierung teilt man jedes Integral durch seine Protonenzahl und erhält das Stoffmengenverhältnis der Komponenten.
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Worum es geht
Ein ¹H-NMR-Spektrum zeigt nicht nur, welche Protonen eine Substanz enthält, sondern auch, wie viele. Das Integral der Signale liefert Protonenverhältnisse und mit einem internen Standard sogar absolute Gehalte. So prüft man Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen, ohne eine Referenzsubstanz des Analyten zu brauchen.
Integrationskurve
Über einem ¹H-Spektrum zeichnet die Software meist eine stufenförmige Integrationskurve. Jede Stufe entspricht dem Integral, also der Fläche unter einem Signal. Diese Fläche ist proportional zur Zahl der Kerne, die das Signal erzeugen. Die Stufenhöhen geben deshalb direkt das Protonenverhältnis der Gruppen an.
Absolute Zahlen liefert das Spektrum allein nicht. Man setzt eine Stufe auf eine plausible Protonenzahl und rechnet die übrigen danach um. Bei Ethylacetat stehen das Quartett der \(\ce{OCH2}\)-Gruppe bei 4,1 ppm, das Singulett der Acetyl-\(\ce{CH3}\) bei 2,0 ppm und das Triplett der Ethyl-\(\ce{CH3}\) bei 1,3 ppm im Verhältnis 2 : 3 : 3.
Die Signalhöhe taugt dafür nicht. Eine Kopplung verteilt dieselbe Fläche auf mehrere Linien. Ein Quartett aus zwei Protonen ist daher viel flacher als ein Singulett aus zwei Protonen, obwohl beide gleich groß integrieren. Auch die Halbwertsbreite eines Signals sagt nichts über die Kernzahl aus.
Umgekehrt verrät die Fläche nichts über die elektronische Abschirmung eines Kerns. Diese liest man allein an der chemischen Verschiebung ab, und die Lage eines Signals sagt wiederum nicht, wie viele Kerne beteiligt sind.
Quantitative NMR
Weil die Fläche nur von der Kernzahl abhängt, eignet sich NMR zur Gehaltsbestimmung. Diese quantitative NMR (qNMR) beruht allein auf Kernresonanz. Man wiegt Probe und einen internen Standard genau ein und vergleicht die Integrale. Der Gehalt des Standards muss bekannt sein. Ein Referenzmaterial des Analyten selbst braucht man dagegen nicht, anders als bei Methoden mit Kalibrierung.
Ein guter Standard ist rein, stabil und genau wägbar. Er zeigt ein scharfes Signal, meist ein Singulett, in einem freien Bereich des Spektrums. Bewährt hat sich Maleinsäure: Ihre beiden olefinischen Protonen geben ein Singulett bei etwa 6,3 ppm. Flüssiger Stickstoff kühlt nur den Magneten und dient nie als Standard.
Integral geteilt durch Protonenzahl ist proportional zur Stoffmenge. Gleiche Integrale je Proton bedeuten gleiche Stoffmengen beider Komponenten.
Daraus folgt die Grundgleichung der qNMR mit internem Standard:
\[m_x = m_{St} \cdot \frac{I_x}{I_{St}} \cdot \frac{N_{St}}{N_x} \cdot \frac{M_x}{M_{St}}\]
\(m\): Masse in mg, \(I\): Integral, \(N\): Protonenzahl des ausgewerteten Signals, \(M\): Molmasse in g/mol; \(x\) steht für den Analyten, \(St\) für den Standard.
Ist der Standard nicht ganz rein, multipliziert man zusätzlich mit seinem Gehalt. Ein Beispiel mit Paracetamol (\(M\) = 151,16 g/mol) und Maleinsäure (\(M\) = 116,07 g/mol) in DMSO-d6:
- Signale wählen: Maleinsäure-Singulett bei 6,3 ppm (2 H), Acetyl-Singulett des Paracetamols bei 2,0 ppm (3 H).
- Integrale ablesen: \(I_{St}\) = 2,00 und \(I_x\) = 3,00 bei 10,0 mg eingewogener Maleinsäure.
- Einsetzen: \(m_x = 10{,}0 \cdot \frac{3{,}00}{2{,}00} \cdot \frac{2}{3} \cdot \frac{151{,}16}{116{,}07}\) mg.
- Ergebnis: \(m_x \approx\) 13,0 mg Paracetamol.
Ohne Standard hilft die Normalisierung. Man teilt jedes Integral durch seine Protonenzahl und setzt die Summe aller Komponenten auf 100 %. So erhält man das Stoffmengenverhältnis der Komponenten einer Probe. Die Umrechnung in Massen folgt der Stöchiometrie.
Nach demselben Prinzip bestimmt man den Substitutionsgrad von Oligosacchariden, oft getrennt für einzelne Positionen der Monomere. Voraussetzung ist, dass substituierte und unsubstituierte Protonen verschiedene Verschiebungen zeigen. Man setzt dann deren Integrale ins Verhältnis, nicht das Gesamtintegral zum Integral des substituierten Protons. Die Messung gelingt auch im ¹³C-Spektrum, ein COSY ist nicht zwingend nötig.
Quiz
Aussage 1
Sind die Integrale je Proton von Analyt und Standard gleich groß, liegen beide Stoffe in gleicher Stoffmenge vor.
Integral je Proton ist proportional zur Stoffmenge. Die Massen unterscheiden sich dann nur im Verhältnis der Molmassen.
Aussage 2
Teilt man die Integrale zweier Komponenten jeweils durch die Protonenzahl des Signals, erhält man ihr Stoffmengenverhältnis.
Das ist die Normalisierung: Integral je Proton ist proportional zur Stoffmenge.
Aussage 3
Im ¹H-NMR-Spektrum lässt sich die Zahl der Protonen einer Gruppe an der Höhe ihres Signals ablesen.
Maßgeblich ist die Fläche (Integral). Ein Quartett aus zwei Protonen ist viel flacher als ein Singulett aus zwei Protonen, integriert aber gleich.
Aussage 4
Für eine qNMR-Gehaltsbestimmung mit internem Standard benötigt man ein Referenzmaterial des Analyten mit bekannter Reinheit.
Bekannt sein muss nur der Gehalt des internen Standards. Ein Referenzmaterial des Analyten ist nicht nötig.
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