Elektrospray-Ionisation und mehrfach geladene Ionen
Wie die Elektrospray-Ionisation aus einer Lösung freie Ionen erzeugt, welche Ionenarten sie liefert und wie man mehrfach geladene Ionen im Spektrum erkennt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Elektrospray-Ionisation (ESI) ist ein weiches Ionisationsverfahren, das gelöste Analyten bei Atmosphärendruck über geladene Tröpfchen in freie Ionen überführt.
- Die Lösung tritt aus einer Kapillare unter Hochspannung aus; beim Verdampfen steigt die Ladungsdichte der Tröpfchen bis zur Coulomb-Explosion, beheizter Stickstoff im Gegenstrom beschleunigt die Desolvatation.
- ESI liefert vor allem Quasimolekülionen und Addukte mit kaum Fragmenten: \(\ce{[M+H]+}\) im Positiv-Modus, \(\ce{[M-H]-}\) im Negativ-Modus, aber keine Radikalkationen.
- \(\ce{[M+Na]+}\) liegt 22 Einheiten über \(\ce{[M+H]+}\); Hydrate wie Ampicillin-Trihydrat zeigen dasselbe \(m/z\) wie die wasserfreie Form.
- Peptide bilden mehrfach geladene Ionen; nach \(m/z = (M+z)/z\) sinkt \(m/z\) mit steigender Ladung, sodass auch sehr große Moleküle erfassbar werden.
- Der Isotopenabstand verrät die Ladung: 1,0 bei \(z\) = 1, 0,5 bei \(z\) = 2.
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Worum es geht
Die Elektrospray-Ionisation (ESI) ist das wichtigste weiche Ionisationsverfahren der Massenspektrometrie. Sie überführt gelöste, polare und auch sehr große Moleküle wie Peptide schonend in die Gasphase. In der Pharmazie braucht man sie für Arzneistoffe, Biologika und Verunreinigungen, die sich nicht unzersetzt verdampfen lassen.
Ablauf der Ionenbildung
Bei der Elektrospray-Ionisation (ESI) ionisiert man kein Gas, sondern eine Lösung. Der Analyt muss deshalb gelöst vorliegen, meist in Wasser, Methanol oder Acetonitril. Unzersetzt verdampfbar muss er dagegen nicht sein. Genau das macht die ESI für polare, thermolabile und große Moleküle so wertvoll.
Die Lösung fließt durch eine feine Mikrokapillare. Zwischen Kapillare und Analysatoreingang liegt eine Hochspannung von einigen Kilovolt. Das elektrische Feld zieht die Flüssigkeit an der Spitze zu einem Kegel aus, dem Taylor-Kegel. Aus ihm reißen feine, elektrisch geladene Tröpfchen ab. Die Ladung gelangt also über die Tröpfchen auf den Analyten.
- Versprühen: Die Hochspannung lädt die Flüssigkeit auf, es entsteht ein Nebel geladener Tröpfchen.
- Desolvatation: Das Lösungsmittel verdampft. Das Tröpfchen schrumpft, seine Ladung bleibt erhalten. Dadurch steigt die Ladungsdichte an der Oberfläche.
- Coulomb-Explosion: Das Tröpfchen zerfällt in kleinere Tochtertröpfchen.
- Freie Ionen: Schrumpfen und Zerfallen wiederholen sich, bis einzelne Analytionen in die Gasphase übertreten.
Zerfall eines geladenen Tröpfchens, sobald die Abstoßung der gleichnamigen Oberflächenladungen stärker wird als die Oberflächenspannung, die es zusammenhält. Die Tochtertröpfchen tragen einen Teil der Ladung und sind zunächst wieder stabil.
Man kann sich das Tröpfchen wie einen Luftballon vorstellen, auf dem gleich viele Magnete einander abstoßen, während er immer kleiner wird. Irgendwann hält die Hülle nicht mehr.
Die Ionisation läuft bei Atmosphärendruck ab, nicht im Hochvakuum. Ein hoher Überdruck ist für das Spray nicht nötig, denn das elektrische Feld erzeugt es. Ein beheizter Stickstoffstrom beschleunigt die Desolvatation. Oft strömt er als Trockengas im Gegenstrom auf die Tröpfchen zu und hält zugleich Lösungsmitteldampf vom Eingang fern. Erst durch eine kleine Öffnung gelangen die Ionen ins Vakuum des Massenanalysators.
Die Hochspannung dient nur dazu, die Flüssigkeit aufzuladen. Ein Lichtbogen, der Metallatome verdampft, kommt bei der ESI nicht vor. Der Weg von der Kapillare bis zur Coulomb-Explosion wird im Examen gerne gefragt: Achte darauf, dass die Ladungsdichte beim Verdampfen steigt und dass alles bei Normaldruck geschieht. Weil die Probe ohnehin als Lösung ankommt, passt die ESI ideal hinter eine HPLC, mehr dazu bei der LC-MS-Kopplung.
Quasimolekül- und Adduktionen
Die Tröpfchen übertragen kaum Energie auf den Analyten. ESI ist deshalb eine weiche Ionisationsmethode mit geringer Anregungsenergie (zur Einordnung siehe harte und weiche Verfahren). Die Moleküle bleiben weitgehend intakt. Im Spektrum dominiert das Quasimolekülion, daneben erscheinen Adduktionen. Fragmente sind selten. In geringem Ausmaß können sie aber schon in der Ionenquelle entstehen, etwa bei erhöhter Spannung am Eingang. Ein Peptid wird daher nie vollständig zerlegt.
Der Grund für die Schonung liegt im Mechanismus. Die Ionen bilden sich durch Übertragung von Protonen oder Anlagerung anderer Kationen. Elektronen werden dabei nicht verschoben. Anders als bei der Elektronenionisation entstehen deshalb keine Radikalkationen \(\mathrm{M}^{\bullet+}\), sondern Ionen mit gerader Elektronenzahl.
Welche Ionen man sieht, hängt von der Polarität der Hochspannung ab. Im Positiv-Modus registriert das Gerät Kationen, typisch das protonierte Molekül \(\ce{[M+H]+}\). Er eignet sich für basische Stoffe wie Amine. Im Negativ-Modus kehrt man die Polarität um und registriert Anionen, typisch das deprotonierte \(\ce{[M-H]-}\). Er eignet sich für Säuren wie Carbonsäuren oder Sulfonamide. Das negative Ion entsteht also durch Abgabe eines Protons und nicht durch Anlagerung eines Elektrons.
| Ion | Entstehung | Modus | \(m/z\) bei \(M\) = 300 Da |
|---|---|---|---|
| \(\ce{[M+H]+}\) | Anlagerung von \(\ce{H+}\) | positiv | 301 |
| \(\ce{[M+Na]+}\) | Anlagerung von \(\ce{Na+}\) | positiv | 323 |
| \(\ce{[M-H]-}\) | Abgabe von \(\ce{H+}\) | negativ | 299 |
| \(\ce{[M+2H]^2+}\) | Anlagerung von zwei \(\ce{H+}\) | positiv | 151 |
Natrium-Addukte stammen aus Glasgefäßen, Puffern oder Salzresten. \(\ce{[M+Na]+}\) liegt 22 Einheiten über \(\ce{[M+H]+}\), denn Natrium (23) ersetzt das Proton (1). Es hat also ein anderes \(m/z\) und darf nicht als zweite Substanz gedeutet werden.
Kristallwasser zählt nicht zum Ion. In Lösung zerfällt ein Hydrat in Wasser und das eigentliche Molekül. Ampicillin und Ampicillin-Trihydrat liefern deshalb dasselbe \(\ce{[M+H]+}\) bei \(m/z\) 350. Die ESI eignet sich auch für niedermolekulare Analyte wie diesen und ist nicht auf Biomoleküle beschränkt.
ESI als weiche Methode ist ein Examensklassiker: Sie liefert vor allem Quasimolekülionen wie \(\ce{[M+H]+}\) oder \(\ce{[M-H]-}\) und Addukte wie \(\ce{[M+Na]+}\), aber kaum Fragmente. Radikalkationen wie bei der EI entstehen nicht, weil Protonen statt Elektronen übertragen werden.
Mehrfach geladene Ionen
Große Moleküle mit vielen basischen Gruppen nehmen bei der ESI oft mehrere Protonen auf. Peptide und Proteine tragen Aminogruppen am N-Terminus sowie in den Seitenketten von Lysin, Arginin und Histidin. So entstehen mehrfach geladene Ionen wie \(\ce{[M+2H]^2+}\) oder \(\ce{[M+3H]^3+}\). Ein kleineres Peptid wie das Lipopeptid-Antibiotikum Daptomycin zeigt im Positiv-Modus im Wesentlichen \(\ce{[M+H]+}\) und \(\ce{[M+2H]^2+}\). Proteine bilden ganze Ladungsserien.
Das Gerät misst nicht die Masse, sondern das Masse-Ladungs-Verhältnis. Mit jeder zusätzlichen Ladung sinkt \(m/z\) also. In einer Ladungsserie stehen deshalb die hoch geladenen Ionen links bei kleinem \(m/z\).
\[m/z = \frac{M + z}{z}\]
\(M\) ist die Molekülmasse in Da, \(z\) die Zahl der angelagerten Protonen und damit die Ladungszahl. Jedes Proton bringt rund 1 Da Masse mit.
Daraus folgt ein großer Vorteil. Viele Analysatoren erfassen nur \(m/z\)-Werte bis einige Tausend. Ein Protein mit \(M\) = 12 000 Da läge einfach geladen weit außerhalb. Zeigt es ein Signal bei \(m/z\) 1001, lässt sich \(z\) berechnen: \(1001 \cdot z = 12\,000 + z\), also \(1000 \cdot z = 12\,000\) und \(z\) = 12. Durch die Mehrfachladung werden Moleküle über der oberen \(m/z\)-Grenze erfassbar.
Ohne bekannte Masse verrät das Isotopenmuster die Ladung. Benachbarte Isotopologe unterscheiden sich um etwa 1 Da, meist durch ein \(\ce{^{13}C}\) statt \(\ce{^{12}C}\). Auf der \(m/z\)-Achse erscheint dieser Unterschied geteilt durch \(z\). Einfach geladene Ionen zeigen daher Isotopenabstände von 1,0, zweifach geladene von 0,5 und dreifach geladene von etwa 0,33.
So ordnest du zwei Signale eines Peptids zu, etwa bei \(m/z\) 1201,6 und 601,3:
- Ladung bestimmen: Isotopenabstand 1,0 beim ersten Signal bedeutet \(z\) = 1, Abstand 0,5 beim zweiten bedeutet \(z\) = 2.
- Masse berechnen: Nach \(M = z \cdot (m/z) - z\) ergibt sich \(1201{,}6 - 1 = 1200{,}6\) und \(2 \cdot 601{,}3 - 2 = 1200{,}6\).
- Zuordnen: Beide Signale führen auf dieselbe Masse. Es sind \(\ce{[M+H]+}\) und \(\ce{[M+2H]^2+}\) desselben Moleküls.
Diese Zuordnung solltest du sicher können: Abstand 0,5 bedeutet \(z\) = 2, und beide Signale müssen auf dieselbe Masse \(M\) zurückführen.
Ein Signal bei etwa halbem \(m/z\) des \(\ce{[M+H]+}\) ist meist kein Abbauprodukt mit kleinerer Masse. Es ist dasselbe Molekül als \(\ce{[M+2H]^2+}\), erkennbar am Isotopenabstand von 0,5.
Quiz
Aussage 1
Die Elektrospray-Ionisation findet im Hochvakuum statt, damit die Tröpfchen ungestört verdampfen können.
Die ESI läuft bei Atmosphärendruck ab. Erst hinter einer kleinen Öffnung gelangen die Ionen ins Vakuum des Analysators.
Aussage 2
Ampicillin-Trihydrat zeigt im ESI-Spektrum ein \(\ce{[M+H]+}\)-Signal, das um die Masse von drei Wassermolekülen höher liegt als das von wasserfreiem Ampicillin.
Das Kristallwasser trennt sich in Lösung ab. Beide Formen liefern dasselbe \(\ce{[M+H]+}\) bei \(m/z\) 350.
Aussage 3
Für die ESI-MS muss ein Analyt unzersetzt in die Gasphase verdampfbar sein.
Der Analyt muss nur gelöst vorliegen. Deshalb eignet sich die ESI gerade für thermolabile und große Moleküle.
Aussage 4
Liegen die Isotopenpeaks eines Signals 0,5 \(m/z\)-Einheiten auseinander, trägt das Ion zwei Ladungen.
Der Massenunterschied von etwa 1 Da zwischen Isotopologen wird durch \(z\) geteilt. Bei \(z\) = 2 ergibt sich ein Abstand von 0,5.
Aussage 5
Im Positiv-Modus der ESI ist das Radikalkation \(\mathrm{M}^{\bullet+}\) das typische Signal eines Arzneistoffs.
Die ESI überträgt Protonen und keine Elektronen. Typisch ist das protonierte Quasimolekülion \(\ce{[M+H]+}\).
Aussage 6
Wenn das Lösungsmittel aus einem ESI-Tröpfchen verdampft, nimmt die Ladungsdichte an seiner Oberfläche zu, bis es durch Coulomb-Explosion zerfällt.
Das Tröpfchen schrumpft bei gleichbleibender Ladung. Übersteigt die Abstoßung die Oberflächenspannung, zerfällt es in Tochtertröpfchen.
Aussage 7
Bei einfach geladenen Ionen erscheint das Natrium-Addukt \(\ce{[M+Na]+}\) 22 \(m/z\)-Einheiten oberhalb von \(\ce{[M+H]+}\).
Natrium (23) ersetzt das Proton (1), die Differenz beträgt also 22.
Aussage 8
Ein Protein mit der Masse 12 000 Da, das zwölf Protonen aufgenommen hat, erscheint im ESI-Spektrum bei etwa \(m/z\) 1001.
Nach \(m/z = (M+z)/z\) gilt \((12\,000 + 12)/12 = 1001\). So bleibt das große Molekül im Messbereich.
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