Fluorimetrische Gehaltsbestimmung und Arzneibuchprüfungen
Wie man fluorimetrische Messwerte über eine Referenzlösung in Konzentrationen umrechnet und wo das Arzneibuch die Fluorimetrie einsetzt, vom Riboflavin bis zur Aluminiumprüfung von Kaliumchlorid.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Einpunkt-Kalibrierung wertet eine fluorimetrische Messung über eine einzige Referenzlösung bekannter Konzentration aus und setzt einen linearen Zusammenhang voraus.
- Aus \(I = k \cdot c\) folgt \(c_x = \frac{I_x \cdot c_r}{I_r}\); Gerätefaktoren und Schichtdicke kürzen sich heraus.
- Oberhalb des linearen Bereichs wird verdünnt, auch Proben für die Proteinbestimmung müssen nicht unverdünnt gemessen werden.
- Riboflavin fluoresziert dank seines Isoalloxazin-Gerüsts und wird direkt bestimmt, auch Tetracyclin ist fluorimetrisch quantifizierbar.
- \(\ce{Al^3+}\) bildet mit 8-Hydroxychinolin ein in Chloroform extrahierbares Oxinat; die Prüfung von Kaliumchlorid läuft bei pH 6,0 mit Anregung bei 392 nm und grüner Emission bei 518 nm.
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Worum es geht
Ein Fluorimeter liefert nur relative Intensitäten. Erst der Vergleich mit einer Lösung bekannter Konzentration macht daraus einen Gehalt. Im Arzneibuch nutzt man das für eigenfluoreszente Arzneistoffe wie Riboflavin und für empfindliche Grenzprüfungen auf Metallspuren.
Auswertung über Referenzlösungen
Fluorimetrische Messungen wertet man immer nach Kalibrierung mit Vergleichslösungen aus. Man kann mehrere Vergleichslösungen messen und eine Kalibrierkurve erstellen (Kalibrierung quantitativer Verfahren). Meist genügt jedoch eine einzige Referenzlösung.
Auswertung mit nur einer Referenzlösung bekannter Konzentration. Sie setzt voraus, dass Intensität und Konzentration im Messbereich linear zusammenhängen und die Gerade durch den Nullpunkt geht.
Im linearen Konzentrationsbereich gilt \(I = k \cdot c\). Die Formel für die Probe leitet man so ab:
- Proportionalität ansetzen: \(I_x = k \cdot c_x\) für die Probe, \(I_r = k \cdot c_r\) für die Referenz.
- Gleichungen dividieren: \(k\) kürzt sich heraus, es bleibt \(\frac{c_x}{c_r} = \frac{I_x}{I_r}\).
- Nach \(c_x\) auflösen: \(c_x = \frac{I_x \cdot c_r}{I_r}\).
Die Konstante \(k\) enthält Gerätefaktoren, Quantenausbeute und Schichtdicke. Weil beide Lösungen unter gleichen Bedingungen gemessen werden, fallen diese Größen weg.
Die Berechnung \(c_x = \frac{I_x \cdot c_r}{I_r}\) solltest du sicher können. Achte darauf, dass die Schichtdicke der Küvette nicht in die Rechnung eingeht.
Ein Beispiel: Die Referenzlösung mit 2,0 µg/mL liefert die Intensität 80, die Probe 60. Dann gilt \(c_x = 60 \cdot 2{,}0 / 80 = 1{,}5\) µg/mL.
Oberhalb des linearen Bereichs knickt die reale Kurve ab, und die Einpunkt-Rechnung liefert zu niedrige Werte. Zu konzentrierte Proben verdünnt man deshalb. Auch Proben für die fluorimetrische Proteinbestimmung müssen nicht unverdünnt vermessen werden. Der Verdünnungsfaktor geht dann in das Ergebnis ein.
Eigenfluoreszenz von Arzneistoffen
Am einfachsten ist die Bestimmung, wenn der Arzneistoff selbst fluoresziert. Riboflavin (Vitamin \(\mathrm{B_2}\)) zeigt dank seines starren, konjugierten Isoalloxazin-Gerüsts eine starke Eigenfluoreszenz. Man misst es deshalb direkt, ohne vorherige Derivatisierung.
Auch Tetracyclin lässt sich fluorimetrisch quantifizieren. Stoffe ohne eigenen Fluorophor macht man dagegen erst durch Fluoreszenzmarkierung messbar.
Aluminium mit 8-Hydroxychinolin
Das Ion \(\ce{Al^3+}\) fluoresziert selbst nicht. Mit 8-Hydroxychinolin (Oxin, HOx) bildet es aber einen fluoreszierenden Chelatkomplex, das Aluminiumoxinat:
\[\ce{Al^3+ + 3 HOx -> Al(Ox)3 + 3 H+}\]
Jeder Ligand bindet über den Ring-Stickstoff und den deprotonierten phenolischen Sauerstoff. So entsteht je ein Fünfring-Chelat. Drei Liganden ergeben einen neutralen Komplex, der sich in Chloroform extrahieren lässt.
Ein chelatbildendes Fluoreszenzreagenz wie Oxin erkennt man an einer OH-Gruppe direkt neben dem Ring-Stickstoff, also in 8-Stellung. Nur diese Nachbarschaft erlaubt den Fünfring mit dem Metall.
Das Arzneibuch (Ph. Eur.) nutzt die Reaktion für die Reinheitsprüfung von Kaliumchlorid auf Aluminium. Man puffert auf pH 6,0, schüttelt mit Oxin in Chloroform aus und misst gegen eine Referenz- und eine Blindlösung. Angeregt wird im UV bei 392 nm, die grüne Fluoreszenz misst man bei 518 nm. Die Nachweisgrenze reicht bis in den ppb-Bereich.
Oxin ist nicht spezifisch für Aluminium. Es bildet auch mit anderen mehrwertigen Kationen Oxinate, nicht nur mit dreiwertigen. Erst der pH-Wert 6,0 erhöht die Selektivität für Aluminium. Die Methode dient nur der Grenzprüfung. Den Gehalt von Kaliumchlorid bestimmt man anders, nämlich argentometrisch. Die klassischen Nachweise von Aluminium findest du bei Aluminium in der Kationenanalyse.
Quiz
Aussage 1
Riboflavin muss vor der fluorimetrischen Bestimmung mit einem Fluoreszenzmarker umgesetzt werden.
Riboflavin ist durch sein Isoalloxazin-Gerüst stark eigenfluoreszent und wird direkt gemessen.
Aussage 2
Bei der Aluminiumprüfung von Kaliumchlorid regt man das Oxinat bei 392 nm an und misst die grüne Fluoreszenz bei 518 nm.
Die Anregung liegt im UV bei 392 nm, die Emission im Grünen bei 518 nm, nach Extraktion in Chloroform bei pH 6,0.
Aussage 3
Zeigt eine Referenzlösung mit 4 µg/mL die doppelte Fluoreszenzintensität einer Probe, enthält die Probe im linearen Bereich 2 µg/mL.
Nach \(c_x = c_r \cdot I_x / I_r\) ergibt sich \(4 \cdot 0{,}5 = 2\) µg/mL.
Aussage 4
Bei der fluorimetrischen Einpunkt-Kalibrierung muss die Schichtdicke der Küvette in die Konzentrationsberechnung einbezogen werden.
Die Schichtdicke steckt in der Konstanten \(k\) und kürzt sich beim Verhältnis von Probe und Referenz heraus. Es gilt einfach \(c_x = \frac{I_x \cdot c_r}{I_r}\).
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