Aufbau und Betrieb des Fluorimeters
Wie ein Fluorimeter aufgebaut ist, warum es die Fluoreszenz seitlich misst und welche Messbedingungen die Nachweisgrenze bestimmen.
Das Wichtigste in Kürze
- Ein Fluorimeter regt eine Probe mit ausgewählter Wellenlänge an und misst ihr Fluoreszenzlicht getrennt vom Anregungslicht.
- Reihenfolge: Lichtquelle, Anregungsmonochromator, Küvette, Emissionsmonochromator, Detektor. Ein Nicol’sches Prisma gehört nicht dazu.
- Die 90°-Anordnung hält Anregungslicht vom Detektor fern. Sie erhöht weder Intensität noch Quantenausbeute und ersetzt weder Anregungsmonochromator noch Blindwert.
- Angeregt wird mit einem Kontinuumstrahler oder Laser im Bereich des Absorptionsmaximums, bei Chinin um 350 nm.
- Lösungsmittel sollen wenig Eigenabsorption und Eigenfluoreszenz zeigen und werden entgast. Höhere Anregungsintensität senkt die Nachweisgrenze.
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Worum es geht
Ein Fluorimeter regt eine Probe mit Licht an und misst das Licht, das sie danach selbst aussendet. Das funktioniert nur mit einem Aufbau, der das starke Anregungslicht vom schwachen Fluoreszenzlicht trennt. In der Pharmazie nutzt man das für empfindliche Gehaltsbestimmungen, etwa von Chinin.
Bauteile im Strahlengang
Ein Fluorimeter besteht aus fünf Bauteilen in fester Reihenfolge. Die Lichtquelle liefert die Anregungsstrahlung. Der Anregungsmonochromator steht zwischen Lichtquelle und Küvette. Er wählt die Wellenlänge aus, mit der die Probe angeregt wird.
In der Messküvette absorbiert der Analyt und fluoresziert. Der Emissionsmonochromator steht zwischen Küvette und Detektor. Er lässt nur die gewünschte Fluoreszenzwellenlänge zum Detektor durch, meist einem Photomultiplier. Lampen, Monochromatoren und Detektoren selbst sind beim UV-Vis-Spektralphotometer erklärt.
Zwei Monochromatoren, zwei Aufgaben: Der erste vor der Küvette legt fest, womit angeregt wird. Der zweite hinter der Küvette legt fest, was gemessen wird.
Ein Blockschema prüfst du am besten entlang des Lichtwegs:
- Start: Am Anfang steht die Lichtquelle.
- Vor der Probe: Zwischen Quelle und Küvette sitzt der Anregungsmonochromator.
- Nach der Probe: Zwischen Küvette und Detektor sitzt der Emissionsmonochromator. Dieser Zweig zweigt seitlich ab.
- Fremdkörper: Ein Nicol’sches Prisma gehört nicht hierher. Es polarisiert Licht und ist Teil des Polarimeters.
90°-Anordnung
Ein angeregtes Molekül strahlt seine Fluoreszenz in alle Raumrichtungen ab. Das Anregungslicht dagegen läuft als gerichteter Strahl geradeaus durch die Küvette. Ein Detektor in der Strahlachse (180°) sähe vor allem durchgelassenes Anregungslicht. Das schwache Fluoreszenzsignal ginge darin unter.
Das Fluoreszenzlicht wird nicht in der Achse des Anregungsstrahls erfasst, sondern in einem Winkel dazu, meist im rechten Winkel. So gelangt kaum Anregungslicht in den Emissionsstrahlengang.
Der Rest des Anregungsstrahls endet in einer Strahlfalle. Man kann sich das wie Staub im Sonnenstrahl vorstellen: Von der Seite sieht man ihn leuchten, beim Blick direkt in die Sonne nicht.
Der Gewinn der Anordnung ist ein dunkler Hintergrund, kein stärkeres Signal. Die Fluoreszenz ist bei 90° nicht intensiver als in anderen Richtungen. Drei Dinge leistet die Anordnung deshalb nicht:
- Sie erhöht die Quantenausbeute nicht. Diese ist eine Eigenschaft des Stoffs unter den gegebenen Bedingungen.
- Sie ersetzt den Anregungsmonochromator nicht. Die Anregungswellenlänge muss trotzdem gezielt ausgewählt werden.
- Sie macht Blindwertmessungen nicht überflüssig. Streulicht und Eigenfluoreszenz des Lösungsmittels erreichen auch den seitlichen Detektor.
Anregung
Als Lichtquelle eignen sich Strahler mit kontinuierlichem Emissionsspektrum, typisch eine Xenonlampe. Aus ihrem breiten Spektrum schneidet der Anregungsmonochromator jede gewünschte Wellenlänge heraus. Auch Laser sind verwendbar. Sie liefern intensives Licht einer festen Wellenlänge.
Polychromatisches UV-Licht muss man dagegen nicht einstrahlen. Angeregt wird gezielt mit einer passenden Wellenlänge. Man wählt sie im Bereich des Absorptionsmaximums des Analyten. Dort absorbiert er am meisten Licht und fluoresziert entsprechend am stärksten.
Chinin in verdünnter Schwefelsäure zeigt das gut. Es wird um 350 nm angeregt und um 450 nm gemessen. Die Emission liegt langwelliger als die Anregung, das ist die Stokes-Verschiebung.
Lösungsmittel
Das Lösungsmittel liegt im Strahlengang und darf die Messung nicht verfälschen. Es soll unter den Messbedingungen möglichst wenig Eigenabsorption zeigen. Sonst schwächt es Anregungs- und Fluoreszenzlicht. Ebenso gering soll seine Eigenfluoreszenz sein, denn sie erhöht den Blindwert.
Idealerweise wird das Lösungsmittel entgast, etwa durch Einleiten von Stickstoff. Gelöster Sauerstoff wirkt als Fluoreszenzlöscher und senkt das Signal.
Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Die Fluoreszenzintensität ist bei kleinen Konzentrationen proportional zu Anregungsintensität, Quantenausbeute und Absorption des Analyten. Das beschreibt die Grundgleichung der Fluoreszenzintensität. Alles, was dieses Signal hebt oder den Untergrund senkt, verbessert Nachweis- und Bestimmungsgrenze.
| Einflussgröße | Wirkung auf die Grenzen |
|---|---|
| Intensität des Anregungslichts | höhere Intensität, stärkeres Signal, niedrigere Nachweisgrenze |
| Wellenlänge des Anregungslichts | nahe am Absorptionsmaximum am günstigsten |
| Lösungsmittel | Eigenabsorption, Eigenfluoreszenz und Sauerstoff verschlechtern sie |
| Quantenausbeute der Substanz | je höher, desto niedriger die Grenzen |
Ein Beispiel: Verdoppelt man die Anregungsintensität, verdoppelt sich das Fluoreszenzsignal. Damit lassen sich kleinere Konzentrationen noch vom Rauschen unterscheiden.
Auch ein empfindlicherer Detektor hilft. Er verschlechtert die Präzision nicht, sondern hebt schwache Signale besser aus dem Rauschen.
Quiz
Aussage 1
Erhöht man die Intensität des Anregungslichts, sinkt die Nachweisgrenze einer fluorimetrischen Bestimmung.
Das Fluoreszenzsignal steigt proportional mit der Anregungsintensität, sodass kleinere Konzentrationen vom Rauschen unterscheidbar werden.
Aussage 2
Laser sind als Anregungsquelle in der Fluorimetrie geeignet.
Neben Kontinuumstrahlern wie der Xenonlampe lassen sich Laser verwenden, die intensives Licht einer festen Wellenlänge liefern.
Aussage 3
Ein Nicol’sches Prisma vor der Küvette gehört zur Grundausstattung eines Fluorimeters.
Das Nicol’sche Prisma polarisiert Licht und ist Bauteil des Polarimeters. Vor der Küvette steht im Fluorimeter der Anregungsmonochromator.
Aussage 4
Der Emissionsmonochromator eines Fluorimeters befindet sich zwischen Messküvette und Detektor.
Er filtert das aus der Küvette kommende Licht und lässt nur die Fluoreszenzwellenlänge zum Detektor durch.
Aussage 5
Dank der 90°-Anordnung kann man in der Fluorimetrie auf Blindwertmessungen verzichten.
Streulicht und Eigenfluoreszenz des Lösungsmittels erreichen auch den seitlichen Detektor. Blindwerte bleiben nötig.
Aussage 6
Man misst die Fluoreszenz im rechten Winkel, weil sie in dieser Richtung am intensivsten abgestrahlt wird.
Fluoreszenz wird in alle Richtungen abgestrahlt. Der Winkel dient dazu, das geradeaus laufende Anregungslicht vom Detektor fernzuhalten.
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