Sekundärstruktur von Peptiden und Proteinen mittels CD
Wie die Fern-UV-CD-Spektroskopie die Anteile von α-Helix, β-Faltblatt und Random Coil in Peptiden und Proteinen erfasst.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Sekundärstruktur ist die durch Wasserstoffbrücken des Peptidrückgrats stabilisierte regelmäßige Faltung: α-Helix, β-Faltblatt oder ungeordneter Random Coil.
- Chromophor ist die Peptidbindung, die im Fern-UV unterhalb von 250 nm absorbiert (n→π* um 220 nm, π→π* um 190 nm).
- Die α-Helix zeigt ein positives Maximum bei 192 nm und negative Banden bei 208 und 222 nm, das β-Faltblatt ein Minimum bei 217 nm, der Random Coil ein starkes Minimum bei 198 nm.
- Durch Zerlegen des gemessenen Spektrums in Referenzspektren erhält man die Sekundärstrukturanteile von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen, nicht aber deren Lage in der Sequenz.
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Worum es geht
Proteine verraten über ihr CD-Spektrum im Fern-UV, wie ihr Rückgrat gefaltet ist. Die Methode baut auf den CD-Spektren und dem Cotton-Effekt auf. In der Pharmazie prüft man damit, ob Peptid- und Proteinarzneistoffe wie Insulin korrekt gefaltet sind.
Sekundärstrukturelemente
Die Sekundärstruktur ist die regelmäßige räumliche Anordnung des Peptidrückgrats. Sie entsteht durch Wasserstoffbrücken zwischen C=O- und N–H-Gruppen der Peptidbindungen. Die Seitenketten sind daran nicht beteiligt.
In der α-Helix windet sich die Kette zu einer rechtsgängigen Schraube mit 3,6 Resten pro Windung. Jede C=O-Gruppe bindet an die N–H-Gruppe des viertnächsten Rests, die Brücken laufen also entlang der Helixachse. Im β-Faltblatt liegen gestreckte Stränge nebeneinander, parallel oder antiparallel. Hier verbinden die Brücken benachbarte Stränge. Als Random Coil bezeichnet man ungeordnete Abschnitte ohne regelmäßiges Brückenmuster.
Der Chromophor für die CD-Messung ist die Peptidbindung selbst. Sie absorbiert im Fern-UV unterhalb von 250 nm: mit einem n→π-Übergang um 220 nm und einem π→π-Übergang um 190 nm. Weil die Peptidbindungen in Helix oder Faltblatt regelmäßig und chiral angeordnet sind, entsteht ein Zirkulardichroismus, dessen Form vom Strukturelement abhängt.
Sekundärstrukturanalyse
Jedes Strukturelement liefert im Fern-UV ein eigenes Bandenmuster. Man trägt die mittlere Elliptizität pro Aminosäurerest auf. So werden Proteine unterschiedlicher Länge vergleichbar.
| Element | Positive Bande | Negative Bande |
|---|---|---|
| α-Helix | 192 nm, stark | 208 nm und 222 nm |
| β-Faltblatt | um 195 nm | 217 nm |
| Random Coil | allenfalls schwach, um 218 nm | 198 nm, stark |
Ein natives Protein enthält meist mehrere Elemente nebeneinander. Sein Spektrum ist dann näherungsweise die Summe der Referenzspektren, gewichtet mit ihren Anteilen. Rechenprogramme zerlegen das gemessene Spektrum in diese Beiträge. Heraus kommen die prozentualen Anteile von α-Helix, β-Faltblatt und Random Coil.
CD liefert Anteile für das ganze Molekül. Wo in der Sequenz eine Helix liegt, verrät das Spektrum nicht.
Das Verfahren funktioniert bei kurzen Peptiden, bei Polypeptiden und bei ganzen Proteinen. Bei Peptiden zeigt das Spektrum etwa, ob sie in Lösung helikal oder ungeordnet vorliegen. Bei Proteinarzneistoffen wie Insulin oder monoklonalen Antikörpern prüft man so, ob die Faltung intakt ist. Bei Denaturierung durch Hitze schwinden die Helixbanden, und das Minimum bei 198 nm wächst.
Quiz
Aussage 1
Aus dem Fern-UV-CD-Spektrum eines Proteins lässt sich ablesen, an welcher Position der Aminosäuresequenz die Helices liegen.
CD liefert nur die prozentualen Anteile der Strukturelemente für das ganze Molekül, keine Zuordnung zu Sequenzabschnitten.
Aussage 2
Für die Sekundärstrukturanalyse misst man den Zirkulardichroismus der Peptidbindung im Nah-UV zwischen 250 und 320 nm.
Die Peptidbindung absorbiert im Fern-UV unterhalb von 250 nm (n→π* um 220 nm, π→π* um 190 nm). Dort wird die Sekundärstruktur gemessen.
Aussage 3
Ein CD-Spektrum mit zwei negativen Banden bei 208 nm und 222 nm spricht für einen hohen α-Helix-Anteil.
Das Doppelminimum bei 208 und 222 nm zusammen mit dem positiven Maximum bei 192 nm ist typisch für die α-Helix.
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