Migration von Ionen und Neutralstoffen mit EOF
Wie sich elektrophoretische und elektroosmotische Beweglichkeit zur Gesamtbeweglichkeit addieren und warum Kationen, Neutralstoffe und Anionen in fester Reihenfolge am Detektor erscheinen.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Gesamtbeweglichkeit eines Teilchens in der CE ist die vorzeichenbehaftete Summe \(\mu_{\text{ges}} = \mu_{\text{ep}} + \mu_{\text{eo}}\). Sie bestimmt die effektive Wanderungsgeschwindigkeit \(v = \mu_{\text{ges}} \cdot E\).
- Die effektive Wanderungsgeschwindigkeit hängt vom EOF ab, wegen des stempelförmigen Profils aber kaum vom Kapillardurchmesser. Die longitudinale Diffusion wirkt nach vorn und nach hinten.
- In Quarzglaskapillaren wandern bei pH 7 und anodischer Probenaufgabe alle Teilchen zur Kathode. Die Migrationsreihenfolge lautet Kationen, Neutralstoffe, Anionen, z. B. Benzylamin, Benzylalkohol, Benzoesäure.
- Bei pH 9,2 trägt der starke EOF auch Anionen zur Kathode. Deshalb ist Levodopa in alkalischem Puffer dort detektierbar.
- Neutralstoffe wie Cholesterol und Progesteron haben keine Eigenmobilität, wandern nur mit dem EOF und sind in freier Lösung nicht trennbar. Ein ungeladener EOF-Marker liefert über \(t_{\text{eo}}\) die Größe \(\mu_{\text{eo}}\).
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Worum es geht
In der Kapillarelektrophorese (CE) bewegt sich jeder Analyt durch zwei Antriebe gleichzeitig: das elektrische Feld und den elektroosmotischen Fluss. Aus ihrer Summe folgt, wann ein Stoff am Detektor ankommt. So lässt sich etwa vorhersagen, ob Ephedrin, Paracetamol oder Ibuprofen zuerst erscheint.
Gesamtbeweglichkeit
Das elektrische Feld zieht einen geladenen Analyten je nach Ladung zur Kathode oder zur Anode. Das beschreibt seine elektrophoretische Mobilität \(\mu_{\text{ep}}\). Zugleich schiebt der elektroosmotische Fluss (EOF) die gesamte Pufferlösung mit der Beweglichkeit \(\mu_{\text{eo}}\) durch die Kapillare. Beide Beiträge addieren sich zur Gesamtbeweglichkeit.
\[\mu_{\text{ges}} = \mu_{\text{ep}} + \mu_{\text{eo}} \qquad v = \mu_{\text{ges}} \cdot E = \mu_{\text{ges}} \cdot \frac{U}{L}\]
Dabei sind die Beweglichkeiten \(\mu\) in m²/(V·s) angegeben. \(v\) ist die effektive Wanderungsgeschwindigkeit in m/s. \(E\) ist die Feldstärke in V/m, also die Spannung \(U\) geteilt durch die Gesamtlänge \(L\) der Kapillare.
Die Summe trägt Vorzeichen wie bei Vektoren. Zählt man die Richtung zur Kathode positiv, haben Kationen ein positives und Anionen ein negatives \(\mu_{\text{ep}}\). Die effektive Wanderungsgeschwindigkeit hängt deshalb immer vom EOF ab. Ein stärkerer EOF beschleunigt jeden Analyten Richtung Kathode, ein schwächerer bremst ihn.
Der EOF entsteht in der dünnen elektrischen Doppelschicht an der Kapillarwand. Von dort zieht er die Flüssigkeit als Ganzes mit. Sein Profil ist flach wie ein Stempel. Anders als bei einer druckgetriebenen Strömung mit parabolischem Profil strömt jede Stelle des Querschnitts gleich schnell.
Der Stempel läuft in einer 50-µm-Kapillare ebenso schnell wie in einer 75-µm-Kapillare. Auch \(\mu_{\text{ep}}\) hängt nicht vom Querschnitt ab. Die effektive Wanderungsgeschwindigkeit ist daher weitgehend unabhängig vom Kapillardurchmesser. Das wird im Examen gerne gefragt: Es zählen Feldstärke und EOF, nicht die Weite der Kapillare. Indirekt wirkt der Durchmesser nur über die stärkere Erwärmung weiter Kapillaren.
Das flache Profil hält die Zonen schmal. Verbreitern kann sie vor allem die longitudinale Diffusion entlang der Kapillarachse. Sie folgt dem Konzentrationsgefälle an beiden Rändern einer Zone. Moleküle diffundieren also nach vorn und nach hinten, nicht nur in Flussrichtung.
Migrationsreihenfolge
In einer unbeschichteten Quarzglaskapillare (Kieselglas) fließt der EOF bei neutralem und alkalischem pH kräftig zur Kathode. Er ist meist stärker als die elektrophoretische Gegenbewegung der Anionen. Deshalb wandern Kationen, Neutralteilchen und Anionen netto zur selben Elektrode. Bei Normalpolung wird die Probe an der Anode aufgegeben, der Detektor sitzt kurz vor der Kathode.
Die Vektoraddition zeigt die Folgen. Beim Kation zeigen beide Pfeile zur Kathode, es ist am schnellsten. Das Neutralteilchen hat nur den EOF-Pfeil. Beim Anion zeigt \(\mu_{\text{ep}}\) gegen den EOF, der resultierende Pfeil ist kürzer.
Daraus ergibt sich die Migrationsreihenfolge bei pH 7: zuerst die Kationen, dann die Neutralstoffe, zuletzt die Anionen. Unter den Kationen kommen kleine, hoch geladene Ionen zuerst. Unter den Anionen erscheinen die mit der größten Eigenmobilität zuletzt.
Ein Zahlenbeispiel macht das greifbar. Angenommen seien \(\mu_{\text{eo}} = 6{,}0 \cdot 10^{-8}\) m²/(V·s), 25 kV an 50 cm Kapillare und der Detektor bei 40 cm. Die Feldstärke beträgt dann 50 000 V/m.
| Teilchen | \(\mu_{\text{ep}}\) in \(10^{-8}\) m²/(V·s) | \(\mu_{\text{ges}}\) in \(10^{-8}\) m²/(V·s) | \(v\) in mm/s | Zeit bis Detektor |
|---|---|---|---|---|
| Kation | +2,0 | 8,0 | 4,0 | 100 s |
| Neutralstoff | 0 | 6,0 | 3,0 | 133 s |
| Anion | −2,5 | 3,5 | 1,75 | 229 s |
Bei pH 9,2, etwa im Boratpuffer, sind fast alle Silanolgruppen deprotoniert. Der EOF wird sehr stark und transportiert auch Anionen mit hoher Eigenmobilität zur Kathode. So lässt sich Levodopa in alkalischem Puffer an der Kathode detektieren, obwohl es dort als Anion vorliegt.
Für gegebene Analyten leitest du die Reihenfolge in drei Schritten ab. Wie Ladung und pH zusammenhängen, erklärt Ladung, pH-Wert und isoelektrischer Punkt.
- Gruppen suchen: Benzylamin trägt eine primäre Aminogruppe (pKs des Ammoniumions etwa 9,3). Benzoesäure trägt eine Carboxylgruppe (pKs etwa 4,2). Benzylalkohol hat nur eine aliphatische OH-Gruppe.
- Mit dem pH vergleichen: Bei pH 7 ist Benzylamin protoniert, also Kation. Benzoesäure ist deprotoniert, also Anion. Benzylalkohol bleibt ungeladen.
- Reihenfolge ablesen: Benzylamin erscheint zuerst, Benzylalkohol mit dem EOF, Benzoesäure zuletzt.
Nach derselben Logik trennen sich Ephedrin, Paracetamol und Ibuprofen bei pH 7. Ephedrin ist als sekundäres Amin protoniert. Paracetamol bleibt neutral, denn sein Phenol (pKs etwa 9,5) ist bei pH 7 kaum dissoziiert und die Amidgruppe ist nicht basisch. Ibuprofen liegt als Carboxylat vor.
Neutralstoffe
Ein Teilchen ohne Ladung erfährt im elektrischen Feld keine Kraft. Es besitzt keine elektrophoretische Eigenmobilität, also gilt \(\mu_{\text{ep}} = 0\) und \(\mu_{\text{ges}} = \mu_{\text{eo}}\). Stillstehen tut es trotzdem nicht. Wie Treibholz in einem Fluss schwimmt es in freier Lösung mit dem EOF zur Kathode.
Alle Neutralstoffe haben damit dieselbe Geschwindigkeit. In freier Lösung lassen sie sich untereinander nicht trennen. Cholesterol und Progesteron besitzen keine ionisierbaren Gruppen und liegen im wässrigen Puffer ungeladen vor. Mit einem einfachen anorganischen Puffer erscheinen sie in einem gemeinsamen Peak. Dasselbe gilt für Benzylalkohol und die Stellungsisomere 1,2- und 1,4-Dichlorbenzol. Trennen lassen sich solche Stoffe erst mit Mizellen in der MEKC.
Examensklassiker: Nicht ionisierbare Stoffe wie Cholesterol, Progesteron oder die Dichlorbenzole haben keine Eigenmobilität und wandern nur mit dem EOF zur Kathode. Sie erreichen den Detektor gemeinsam zur EOF-Zeit und werden in freier Lösung deshalb nicht voneinander getrennt.
Genau diese Eigenschaft macht Neutralstoffe nützlich.
Ein EOF-Marker ist ein ungeladener, gut detektierbarer Stoff, der nur mit dem EOF wandert. Aus seiner Migrationszeit \(t_{\text{eo}}\) berechnet man die elektroosmotische Beweglichkeit \(\mu_{\text{eo}}\).
Der Markerpeak teilt das Elektropherogramm in zwei Bereiche: davor die Kationen, dahinter die Anionen. Zieht man \(\mu_{\text{eo}}\) von der gemessenen Gesamtbeweglichkeit ab, erhält man die Eigenmobilität jedes Analyten: \(\mu_{\text{ep}} = \mu_{\text{ges}} - \mu_{\text{eo}}\). Welche Substanzen man konkret als Marker einsetzt, steht unter Messmethodik der Kapillarelektrophorese.
An einer Strukturformel prüfst du deshalb zuerst, ob eine ionisierbare Gruppe vorhanden ist und bei welchem pH sie geladen ist.
| Gruppe | Beispiel | Ladung im Puffer |
|---|---|---|
| Carbonsäure | Benzoesäure, Ibuprofen | Anion ab etwa pH 5 |
| Phenol | Paracetamol | Anion erst stark alkalisch |
| Aliphatisches Amin | Benzylamin, Ephedrin | Kation bis etwa pH 8 |
| Quartäres Ammonium | Neostigmin | Kation bei jedem pH |
| Alkohol, Keton, Ether, Amid, Halogenaromat | Cholesterol, Progesteron, Dichlorbenzol | neutral |
Bei Isomerenpaaren folgt eine zweite Frage: Unterscheiden sie sich in Ladung oder Größe? Enantiomere haben in achiraler Lösung identische pKs-Werte und Größe und wandern gleich schnell. Ihre Trennung braucht einen chiralen Selektor. Stellungsisomere ionisierbarer Stoffe können sich dagegen im pKs und damit in der effektiven Ladung unterscheiden. Sind beide Isomere neutral wie die Dichlorbenzole, hilft das nicht. Weitere Analytpaare beurteilt die Kapillarzonenelektrophorese.
Quiz
Aussage 1
Die longitudinale Diffusion einer Analytzone verläuft ausschließlich in Richtung des elektroosmotischen Flusses.
Diffusion folgt dem Konzentrationsgefälle an beiden Zonenrändern, also nach vorn und nach hinten entlang der Kapillarachse.
Aussage 2
Verdoppelt man den Innendurchmesser der Kapillare, verdoppelt sich auch die effektive Wanderungsgeschwindigkeit eines Analyten näherungsweise.
Der EOF hat ein stempelförmiges Profil, und \(\mu_{\text{ep}}\) hängt nicht vom Querschnitt ab. Die effektive Wanderungsgeschwindigkeit ist daher weitgehend unabhängig vom Kapillardurchmesser.
Aussage 3
Bei pH 7 in einer unbeschichteten Quarzkapillare mit Probenaufgabe an der Anode erreicht Benzoesäure den Detektor vor Benzylamin.
Benzylamin ist bei pH 7 protoniert und erscheint als Kation zuerst. Benzylalkohol folgt mit dem EOF, Benzoesäure kommt als Anion zuletzt.
Aussage 4
Aus der Migrationszeit eines ungeladenen Markerstoffs lässt sich die elektroosmotische Beweglichkeit bestimmen.
Ein Neutralstoff hat \(\mu_{\text{ep}} = 0\), also gilt \(\mu_{\text{ges}} = \mu_{\text{eo}}\). Deshalb dient er als EOF-Marker.
Aussage 5
Die Gesamtbeweglichkeit eines Analyten ergibt sich als Summe aus seiner elektrophoretischen und der elektroosmotischen Beweglichkeit.
Es gilt \(\mu_{\text{ges}} = \mu_{\text{ep}} + \mu_{\text{eo}}\), wobei die Vorzeichen die Richtung berücksichtigen.
Aussage 6
Cholesterol und Progesteron lassen sich in einem einfachen Phosphatpuffer in freier Lösung kapillarelektrophoretisch trennen, weil sie sich in der Molekülgröße unterscheiden.
Beide tragen keine ionisierbaren Gruppen, haben keine Eigenmobilität und wandern nur mit dem EOF. Sie erscheinen gemeinsam zur EOF-Zeit.
Aussage 7
In einer Kieselglaskapillare werden bei pH 9,2 durch den elektroosmotischen Fluss auch Anionen zur Kathode transportiert.
Bei pH 9,2 sind fast alle Silanolgruppen deprotoniert. Der starke EOF übertrifft die Gegenbewegung der Anionen.
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