Ladung, pH-Wert und isoelektrischer Punkt
Wie Puffer-pH, pKs-Werte und Strukturformel die Ladung eines Analyten festlegen und was daraus für Wanderungsrichtung und Mobilität in der Elektrophorese folgt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die effektive Ladung eines Analyten ist die gemittelte Summe der Teilladungen seiner ionisierbaren Gruppen und bestimmt über den Dissoziationsgrad seine Mobilität im Puffer.
- Bei pH = pKs liegt eine Säuregruppe zur Hälfte deprotoniert vor, eine pH-Einheit darüber zu 91 %.
- Bei pH 3 und 5 wandert Amphetamin betragsmäßig schneller als Tyrosin, bei pH 11 Tyrosin schneller als Amphetamin.
- Am isoelektrischen Punkt ist die Nettoladung null und die Mobilität minimal; für neutrale Aminosäuren gilt pI = (pKs1 + pKs2)/2, für Alanin und Glycin etwa 6.
- Proteine sind oberhalb des pI negativ und wandern zur Anode, unterhalb positiv und wandern zur Kathode.
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Worum es geht
Ob und wie schnell ein Analyt in der Elektrophorese wandert, hängt von seiner Ladung ab. Bei Säuren, Basen und Aminosäuren stellt der Puffer-pH diese Ladung ein. Wer pKs-Werte und Strukturformeln lesen kann, sagt Wanderungsrichtung und Reihenfolge voraus und wählt den passenden Trenn-pH, etwa für Paracetamol und seine Verunreinigungen.
Dissoziationsgrad und Mobilität
Schwache Säuren und Basen sind im Puffer oft nur teilweise geladen. Welcher Anteil ionisiert vorliegt, bestimmt der Abstand zwischen Puffer-pH und pKs-Wert. Davon hängt direkt ab, wie schnell ein Analyt im elektrischen Feld wandert.
Der Dissoziationsgrad \(\alpha\) ist der Anteil einer Säure, der deprotoniert vorliegt: \(\alpha = \frac{1}{1+10^{\mathrm{p}K_S-\mathrm{pH}}}\). Er liegt zwischen 0 und 1.
Bei pH = pKs ist \(\alpha\) genau 0,5. Die Säuregruppe liegt also zur Hälfte deprotoniert vor. Eine pH-Einheit darüber sind es 91 %, eine darunter nur 9 %. Für Basen gilt das Spiegelbild: Unterhalb ihres pKs-Werts überwiegt die protonierte, kationische Form. Beides folgt aus der Henderson-Hasselbalch-Gleichung, die bei den Puffern erklärt ist.
Ein einzelnes Molekül ist zu jedem Zeitpunkt entweder geladen oder ungeladen. Protonen wechseln aber viel schneller, als die Trennung dauert. Jedes Molekül wandert deshalb so, als trüge es eine Bruchteilladung.
Die effektive Ladung ist die zeitlich gemittelte Ladung eines Analyten, also die Summe der Teilladungen aller ionisierbaren Gruppen. Sie kann jeden Wert zwischen ganzen Zahlen annehmen.
Die beobachtete Mobilität ist die Mobilität des vollständig geladenen Ions, gewichtet mit dem Dissoziationsgrad:
\[\mu_\mathrm{eff} = \alpha \cdot \mu_\mathrm{ion}\]
Dabei ist \(\mu_\mathrm{eff}\) die effektive Mobilität und \(\mu_\mathrm{ion}\) die Mobilität der voll ionisierten Form, beide in m²/(V·s). Was \(\mu_\mathrm{ion}\) selbst bestimmt, steht bei der elektrophoretischen Mobilität.
Benzoesäure (pKs 4,2) ist zwischen pH 3 und 5 nur teilweise dissoziiert. Ihre Ladung liegt dort zwischen 0 und −1, und ihre Mobilität ändert sich stark mit dem pH. Anders die Methansulfonsäure: Sie ist eine starke Säure und oberhalb von pH 1 praktisch vollständig einfach negativ. Ihre Mobilität hängt im üblichen Pufferbereich kaum vom pH ab. Für Basen gilt dasselbe Prinzip. Das Lokalanästhetikum Ropivacain (pKs 8,1) ist bei pH 6 fast vollständig Kation, bei pH 10 überwiegend neutral. Seine Mobilität hängt daher wesentlich vom Puffer-pH ab. Auch das Elektropherogramm von Aminosäuren verschiebt sich mit dem pH.
Ladung aus der Strukturformel ableiten
Mit vier Schritten kommt man von der Formel zur Mobilität.
- Gruppen finden: Carbonsäure, Sulfonsäure und Phenol sind sauer, aliphatische Amine basisch. Amide wie in Acetanilid sind zwischen pH 1 und 11 nicht ionisierbar.
- pKs zuordnen: Carbonsäuren um 2 bis 5, Phenole um 7 bis 10, protonierte aliphatische Amine um 9 bis 11.
- Mit dem pH vergleichen: Mehr als eine Einheit über dem pKs ist eine Säure praktisch voll deprotoniert und eine Base neutral. Bei pH = pKs ist die Gruppe halb ionisiert.
- Summieren: Das Vorzeichen der effektiven Ladung gibt die Richtung vor, ihr Betrag im Verhältnis zur Größe die Mobilität.
Angewendet auf Paracetamol und verwandte Stoffe bei pH 9,5:
| Analyt | ionisierbare Gruppe | pKs (ca.) | Ladung bei pH 9,5 |
|---|---|---|---|
| Acetanilid | keine (Amid) | – | 0 |
| Paracetamol | Phenol | 9,5 | ≈ −0,5 |
| 4-Aminophenol | Anilinium, Phenol | 5,5 und 10,3 | ≈ −0,14, kein Kation |
| 4-Nitrophenol | Phenol | 7,2 | ≈ −1 |
Neben 4-Nitrophenol sind hier also auch Paracetamol und 4-Aminophenol teilweise anionisch. Die Aminogruppe des 4-Aminophenols ist bei diesem pH längst deprotoniert. Für die Trennung wählt man den pH, an dem sich die Ladungen am stärksten unterscheiden. Bei pH 7 wären Paracetamol und 4-Aminophenol beide nahezu ungeladen. Bei pH 12 wären alle Phenole fast vollständig deprotoniert. Erst um pH 9,5 trägt jeder Analyt eine eigene effektive Ladung.
Mobilitätsvergleich von Analytpaaren
Ein Amin und die zugehörige Aminosäure teilen das Grundgerüst. Die Aminosäure trägt zusätzlich eine Carboxygruppe. Diese eine Gruppe ändert die Ladung je nach pH völlig. Amphetamin hat nur eine primäre Aminogruppe (pKs ≈ 9,9). Tyrosin besitzt eine Carboxygruppe (pKs ≈ 2,2), eine Ammoniumgruppe (pKs ≈ 9,1) und ein Phenol (pKs ≈ 10,1).
| pH | Ladung Amphetamin | Ladung Tyrosin | betragsmäßig höhere Mobilität |
|---|---|---|---|
| 3 | +1 | ≈ +0,15 | Amphetamin |
| 5 | +1 | ≈ 0 (Zwitterion) | Amphetamin, Mobilitäten deutlich verschieden |
| 11 | ≈ +0,07 | ≈ −1,9 | Tyrosin |
Bei pH 3 ist die Carboxygruppe des Tyrosins schon zu gut 80 % deprotoniert. Sie hebt die positive Ladung der Ammoniumgruppe fast auf. Amphetamin bleibt voll kationisch und ist zudem kleiner. Bei pH 5 liegt Tyrosin nahe seinem isoelektrischen Punkt und wandert kaum, während Amphetamin weiter ein Kation ist. Bei pH 11 kehrt sich das Bild um. Amphetamin ist fast neutral, Tyrosin trägt Carboxylat und überwiegend Phenolat und ist nahezu zweifach negativ.
Der Vergleich Amphetamin/Tyrosin wird im Examen gerne gefragt: Bei pH 3 und pH 5 hat Amphetamin die betragsmäßig höhere Mobilität, bei pH 11 Tyrosin. Achte auf die Carboxygruppe, die im Sauren die Ladung der Aminosäure abschwächt und im Basischen zusammen mit dem Phenolat den Betrag der Ladung erhöht.
Dopamin und Levodopa folgen derselben Logik. Bei pH 3 ist Dopamin ein volles Kation. Levodopa trägt durch seine fast vollständig deprotonierte Carboxygruppe nur eine Ladung von etwa +0,2. Dopamin hat also die höhere Mobilität. Bei pH 9 trägt Dopamin über seine Ammoniumgruppe noch eine positive Teilladung. Levodopa ist dort netto negativ, weil das Carboxylat überwiegt. Ihre Mobilitäten unterscheiden sich deutlich, sogar im Vorzeichen.
Isoelektrischer Punkt
Aminosäuren und Proteine tragen saure und basische Gruppen zugleich. Sie sind Ampholyte. Bei einem bestimmten pH heben sich positive und negative Ladungen im Mittel genau auf. Diesen pH nennt man den isoelektrischen Punkt (pI). Dort ist die Nettoladung null und das Zwitterion die vorherrschende Spezies.
Ohne Nettoladung zieht das Feld nicht am Molekül. Die elektrophoretische Mobilität ist am pI minimal, praktisch null. Ein Protein am pI ist nach außen ungeladen und wandert nicht. Diesen Effekt nutzt die isoelektrische Fokussierung.
\[\mathrm{pI} = \frac{\mathrm{p}K_{S1} + \mathrm{p}K_{S2}}{2}\]
Hier sind \(\mathrm{p}K_{S1}\) und \(\mathrm{p}K_{S2}\) die beiden pKs-Werte, zwischen denen das Zwitterion vorliegt. Bei einer neutralen Aminosäure sind das Carboxyl- und Ammoniumgruppe. Ihr pI liegt deshalb immer zwischen diesen beiden Werten. Diese Mittelwert-Rechnung solltest du sicher können, samt der Werte für Alanin (2,3 und 9,7, pI ≈ 6,0) und Glycin (pI ebenfalls etwa 6).
Ein eigenes Beispiel: Serin hat die pKs-Werte 2,2 und 9,2. Der pI liegt bei (2,2 + 9,2)/2 = 5,7. Bei sauren oder basischen Aminosäuren gibt es einen dritten pKs-Wert. Dann mittelt man die beiden Werte, die das Zwitterion einrahmen. Für Asparaginsäure sind das etwa 2,0 und 3,9, der pI liegt also nahe 3,0.
Peptide
Die Peptidbindung selbst ist im üblichen pH-Bereich nicht ionisierbar. Ladung tragen nur die Termini und die Seitenketten. Die N-terminale Aminogruppe hat in Dipeptiden einen pKs um 8, die C-terminale Carboxygruppe um 3.
Phe-Gly hat beide Termini frei. Bei pH 2 ist die Carboxygruppe überwiegend protoniert, das Dipeptid ist ein Kation. Bei pH 5 liegt es als Zwitterion vor, bei pH 10 als Anion. Im Phe-Gly-NH2 ist der C-Terminus ein Amid und damit nicht sauer. Es bleibt bei pH 2 und pH 5 ein Kation. Bei pH 2 wandern beide Dipeptide zur Kathode und werden dort detektiert, wie bei der Messmethodik beschrieben. Bei pH 5 hat das kationische Phe-Gly-NH2 die größere Mobilität als das zwitterionische Phe-Gly.
Glutathion (\(\gamma\)-Glu-Cys-Gly) trägt zwei Carboxygruppen, eine Aminogruppe und das Thiol des Cysteins. Bei pH 8 sind beide Carboxygruppen deprotoniert, die Aminogruppe ist überwiegend protoniert. Das Thiol ist nur zu einem kleinen Teil deprotoniert. Zusammen ergibt sich eine mittlere Ladung von etwa −1,5, je nach angesetzten pKs-Werten etwas weniger negativ.
Wanderungsrichtung von Proteinen
Proteine tragen viele ionisierbare Seitenketten. Für die Wanderungsrichtung zählt aber nur, auf welcher Seite ihres pI der Puffer-pH liegt. Liegt der pH über dem pI, geben die Gruppen netto Protonen ab. Liegt er darunter, nehmen sie welche auf.
pH über pI: Das Protein ist negativ und wandert zur Anode. pH unter pI: Das Protein ist positiv und wandert zur Kathode.
Serumalbumin hat einen pI um 4,8. Bei pH 6,5 ist es deshalb negativ geladen und wandert zur Anode. Vergleicht man es bei pH 8,6 mit Lysozym (pI ≈ 11), trennen sich die beiden in entgegengesetzte Richtungen. Albumin wandert zur Anode, Lysozym zur Kathode. In der Kapillare überlagert der elektroosmotische Fluss diese Eigenbewegung, wie bei der Migration mit EOF gezeigt.
Quiz
Aussage 1
Bei pH 3 wandert Dopamin schneller als Levodopa, weil die Carboxygruppe des Levodopas dessen positive Ladung weitgehend kompensiert.
Dopamin ist bei pH 3 ein volles Kation, Levodopa trägt nur etwa +0,2.
Aussage 2
In einem Puffer mit pH 11 besitzt Amphetamin eine betragsmäßig größere elektrophoretische Mobilität als Tyrosin.
Bei pH 11 ist Amphetamin fast neutral, Tyrosin trägt Carboxylat und überwiegend Phenolat. Tyrosin hat die höhere Mobilität.
Aussage 3
Bei pH 5 wandert das Dipeptidamid Phe-Gly-NH2 schneller als das Dipeptid Phe-Gly.
Phe-Gly-NH2 ist bei pH 5 ein Kation, Phe-Gly liegt als Zwitterion ohne Nettoladung vor.
Aussage 4
4-Aminophenol liegt bei pH 9,5 überwiegend als Kation vor, weil es eine Aminogruppe trägt.
Die Aniliniumgruppe hat einen pKs um 5,5 und ist bei pH 9,5 deprotoniert. 4-Aminophenol ist dort über das Phenol teilweise anionisch.
Aussage 5
Serumalbumin mit einem pI um 4,8 wandert in einem Puffer von pH 6,5 zur Kathode.
Der pH liegt über dem pI, das Protein ist negativ geladen und wandert zur Anode.
Aussage 6
Liegt der Puffer-pH genau beim pKs-Wert einer Carbonsäure, ist die Hälfte ihrer Moleküle deprotoniert.
Bei pH = pKs ist der Dissoziationsgrad 0,5.
Aussage 7
Für Alanin mit den pKs-Werten 2,3 und 9,7 ergibt sich ein isoelektrischer Punkt von etwa 6,0.
pI = (2,3 + 9,7)/2 = 6,0.
Aussage 8
Die Mobilität von Methansulfonsäure steigt zwischen pH 3 und pH 9 stark an, weil sie zunehmend dissoziiert.
Methansulfonsäure ist eine starke Säure und oberhalb von pH 1 praktisch vollständig einfach negativ. Ihre Mobilität hängt in diesem Bereich kaum vom pH ab.
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