Messmethodik der Kapillarelektrophorese
Wie ein Kapillarelektrophorese-Gerät aufgebaut ist, warum bei Normalpolung an der Kathode detektiert wird und wie man Elektropherogramme quantitativ auswertet.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Messmethodik der CE umfasst Kapillare, Hochspannung, Injektion, Detektion und die quantitative Auswertung des Elektropherogramms.
- Kapillaren bestehen aus fused Silica mit Innendurchmessern bis etwa 250 µm, getrennt wird mit 10 bis 30 kV.
- Bei Normalpolung wird an der Anode aufgegeben und an der Kathode detektiert, weil der starke EOF bei pH 9 bis 10 alle Analyten dorthin trägt.
- Geeignete EOF-Marker sind ungeladen, etwa Acetanilid (pH 2–10), Aceton, DMSO und Toluen; Anilin, Benzoesäure und Kaliumbromid sind ungeeignet.
- Für quantitative Bestimmungen nutzt man die korrigierte Peakfläche \(A/t_m\), weil langsamere Analyten länger im Detektionsfenster bleiben.
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Worum es geht
Die Kapillarelektrophorese (CE) trennt Ionen und Neutralstoffe in einer dünnen Glaskapillare unter Hochspannung. Für die Arzneibuchanalytik muss man wissen, wo die Probe aufgegeben und wo detektiert wird, welcher Stoff den EOF anzeigt und warum Peakflächen anders ausgewertet werden als in der HPLC.
Geräteaufbau und Kapillaren
Herzstück ist eine Kapillare aus fused Silica (Quarzglas). Ihr Innendurchmesser liegt meist bei 50 bis 100 µm und reicht bis etwa 250 µm. Außen schützt eine Polyimidschicht das spröde Glas. Beide Enden tauchen in Puffergefäße mit Platinelektroden.
Eine Quelle legt Hochspannung von typischerweise 10 bis 30 kV an. Wenige hundert Volt reichen nicht, denn erst hohe Feldstärken liefern schnelle, scharfe Trennungen. Die dünne Kapillare führt die entstehende Joule-Wärme gut ab.
Die Probe gelangt auf zwei Wegen in die Kapillare. Bei der hydrodynamischen Injektion drückt Überdruck oder Vakuum ein kleines Volumen hinein. Bei der elektrokinetischen Injektion zieht eine kurz angelegte Spannung die Probe ein.
Kurz vor dem Auslass wird die Polyimidschicht auf wenigen Millimetern entfernt. Durch dieses Detektionsfenster fällt das Licht des Detektors direkt durch die Kapillare. Die Strecke vom Einlass bis zum Fenster heißt effektive Länge.
Polung und Detektionsseite
Bei der Normalpolung liegt die Anode am Einlass, wo die Probe aufgegeben wird. Die Kathode liegt am Auslass, vor dem der Detektor sitzt. In einer unbeschichteten Kieselglaskapillare bei pH 9 bis 10 sind die Silanolgruppen weitgehend deprotoniert. Der elektroosmotische Fluss ist dann stark und strömt zur Kathode.
Er wirkt wie ein Förderband, das schneller läuft als die Eigenbewegung der meisten Ionen. So erreichen Kationen, Neutralstoffe wie Benzylalkohol und auch Anionen das kathodische Ende. Eine Detektion an der Anode ist bei diesem pH also nicht nötig. Die Reihenfolge der Peaks leitest du in Migration mit EOF ab.
EOF-Marker
Ein EOF-Marker zeigt, wann der EOF allein am Detektor ankommt. Das Prinzip erklärt die Seite Migration mit EOF. Hier geht es um die Auswahl. Der Stoff muss im gesamten Arbeitsbereich ungeladen sein, UV absorbieren und darf nicht mit der Wand wechselwirken.
| Substanz | Eignung | Grund |
|---|---|---|
| Acetanilid | geeignet (pH 2–10) | Amid, N nicht basisch |
| Aceton | geeignet | neutral |
| Dimethylsulfoxid | geeignet | neutral |
| Toluen | geeignet | neutral |
| Anilin | ungeeignet | im Sauren protoniert |
| Benzoesäure | ungeeignet | im Neutralen und Basischen deprotoniert |
| Glutaminsäure | ungeeignet | je nach pH geladen |
| Kaliumbromid | ungeeignet | liefert Ionen |
| Kaliumhydrogenphthalat | ungeeignet | liegt als Anion vor |
Anilin und Acetanilid zeigen den Unterschied schön. Im Anilin ist das Stickstoff-Elektronenpaar frei und nimmt im Sauren ein Proton auf. Im Acetanilid ist es in die Carbonylgruppe delokalisiert. Deshalb bleibt Acetanilid von pH 2 bis 10 neutral.
Detektoren
Am häufigsten misst ein UV-Detektor direkt durch das Detektionsfenster. Er eignet sich auch für die MEKC, denn Tensidmizellen wie SDS absorbieren im üblichen Messbereich kaum. Die Grundlagen der Absorption findest du unter Elektronenanregung. Da der optische Weg nur dem Innendurchmesser entspricht, ist die Empfindlichkeit begrenzt.
Auflösung
Die Auflösung zweier Peaks berechnet man in der CE aus den Beweglichkeiten und der Bodenzahl:
\[R_s = \frac{\sqrt{N}\,(\mu_{ep,b} - \mu_{ep,a})}{4\,(\bar{\mu}_{ep} + \mu_{EOF})}\]
Dabei sind \(\mu_{ep,a}\) und \(\mu_{ep,b}\) die elektrophoretischen Beweglichkeiten, \(\bar{\mu}_{ep}\) ihr Mittelwert und \(\mu_{EOF}\) die endoosmotische Beweglichkeit. \(N\) ist die scheinbare Bodenzahl. Scheinbar heißt sie, weil sie aus dem Peak bestimmt wird und alle Verbreiterungen mit einschließt. Signal-Rausch-Verhältnis und Injektionsdruck kommen in der Formel nicht vor. Allgemeines zur Auflösung steht unter Auflösung und Peak-Tal-Verhältnis.
Peakfläche und Migrationszeit
In der HPLC strömen alle Peaks mit derselben Fließgeschwindigkeit durch die Messzelle. In der CE wandert dagegen jeder Analyt mit seiner eigenen Geschwindigkeit am Fenster vorbei. Ein langsamer Stoff hält sich länger im Detektionsfenster auf. Sein Peak wird breiter und bei gleicher Konzentration größer. Ein langsamerer EOF verlängert diese Aufenthaltszeit für alle Analyten.
Der UV-Detektor misst konzentrationsabhängig. Die Fläche hängt deshalb nicht nur von der Menge ab, sondern auch von der Migrationszeit. Schon kleine Schwankungen des EOF zwischen zwei Läufen verfälschen so das Ergebnis.
Die Peakfläche geteilt durch die Migrationszeit, \(A_{korr} = A / t_m\). Sie gleicht Schwankungen der Migrationszeit aus und wird für quantitative CE-Bestimmungen verwendet.
Ein Beispiel mit eigenen Zahlen: Stoff X erscheint nach 4,0 min mit der Fläche 1200, Stoff Y nach 5,0 min mit der Fläche 1500. Die korrigierten Flächen betragen beide 300. Beide Stoffe liegen also in gleicher Konzentration vor, obwohl die Rohflächen sich um 25 % unterscheiden.
Peakform
Zwei Ursachen stören die Peakform besonders. Eine zu hohe Probenkonzentration verbreitert die Peaks. Ein Leitfähigkeitsunterschied zwischen Probenzone und Hintergrundelektrolyt macht sie asymmetrisch. In der Probenzone herrscht dann eine andere Feldstärke als im Puffer. Eine Flanke wird geschärft, die andere läuft aus, und es entsteht Fronting oder Tailing.
Konzentration zu hoch: Peak wird breit. Leitfähigkeit passt nicht: Peak wird schief.
Quiz
Aussage 1
In der Kapillarzonenelektrophorese arbeitet man üblicherweise mit Spannungen von wenigen hundert Volt, um Joule-Wärme zu vermeiden.
Üblich sind 10 bis 30 kV. Erst hohe Feldstärken liefern schnelle, scharfe Trennungen.
Aussage 2
Bei gleicher Konzentration liefert in der CE ein später migrierender Analyt am UV-Detektor eine größere Peakfläche als ein früh migrierender.
Der langsamere Analyt hält sich länger im Detektionsfenster auf, sein Peak wird breiter und größer.
Aussage 3
Bei Normalpolung in einer unbeschichteten Quarzkapillare bei pH 9,5 erreicht auch Benzylalkohol den Detektor am kathodischen Ende.
Der starke EOF zur Kathode transportiert auch Neutralstoffe zum Detektor.
Aussage 4
Das Signal-Rausch-Verhältnis geht in die Berechnung der Auflösung in der CE ein.
In die Auflösung gehen die elektrophoretischen Beweglichkeiten, die endoosmotische Beweglichkeit und die scheinbare Bodenzahl N ein.
Aussage 5
Anilin ist als EOF-Marker für pH 2 bis 10 gut geeignet, da es als aromatisches Amin UV-aktiv ist.
Anilin wird im Sauren zum Anilinium-Ion protoniert und ist dann geladen. Ein EOF-Marker muss im ganzen Bereich ungeladen sein.
Aussage 6
Acetanilid eignet sich im Bereich pH 2 bis 10 als EOF-Marker, weil das Elektronenpaar des Stickstoffs in die Carbonylgruppe delokalisiert ist.
Als Amid wird Acetanilid nicht protoniert und bleibt im gesamten Bereich ungeladen.
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