Chromatographische Trennprinzipien
Wie Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch und Größenausschluss Stoffe trennen und wie man für ein Substanzpaar das passende Trennprinzip wählt.
Das Wichtigste in Kürze
- Chromatographie trennt Stoffe durch wiederholte Gleichgewichtseinstellung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase; stärker retinierte Stoffe wandern langsamer.
- Bei der Adsorption an Kieselgel bestimmen vor allem die Polarität der mobilen Phase und die Aktivität der stationären Phase die Retention; die später eluierte Substanz hat die größere Affinität zum Kieselgel.
- Die Verteilung beruht auf dem Verteilungskoeffizienten zwischen zwei nicht mischbaren Phasen; in der HPLC hängt er von der Polarität beider Phasen ab, nicht von Dampfdruck, Kristallstruktur oder Peakbreite.
- Ionenaustausch trennt nach Ladung und damit auch nach \(\mathrm{p}K_\mathrm{a}\); Größenausschluss trennt über den Siebeffekt, große Moleküle eluieren zuerst.
- Diffusion, Extinktionskoeffizienten und Normalpotentiale sind keine Trennprinzipien; Hydrocortison und Prednisolon sind neutral und ähnlich groß und werden über Polarität getrennt.
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Worum es geht
Alle chromatographischen Verfahren beruhen auf demselben Grundgedanken, unterscheiden sich aber darin, welche Stoffeigenschaft sie zur Trennung nutzen. Wer die Trennmechanismen kennt, kann für ein Arzneistoffgemisch gezielt die passende Methode wählen, etwa für die Reinheitsprüfung eines Corticoids.
Prinzip der Chromatographie
Jede Chromatographie arbeitet mit zwei Phasen. Die stationäre Phase ruht, etwa als Kieselgel in einer Säule oder auf einer Platte. Die mobile Phase strömt an ihr vorbei, als Flüssigkeit oder Gas, und trägt das Gemisch mit sich.
Ein Molekül wechselt auf seinem Weg ständig zwischen beiden Phasen. Bei jedem Wechsel stellt sich das Gleichgewicht neu ein, viele tausend Mal hintereinander. Solange ein Molekül in der stationären Phase sitzt, kommt es nicht voran. Wandern kann es nur in der mobilen Phase.
Stoffe, die länger an der stationären Phase verweilen, wandern deshalb langsamer. Dieses Zurückhalten heißt Retention. Das Herausspülen eines Stoffes aus der Säule mit der mobilen Phase heißt Elution. Die Trennung entsteht allein aus den unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten. Warum ein Stoff stärker zurückgehalten wird, legt der Trennmechanismus fest.
Adsorption
Bei der Adsorption binden Analytmoleküle reversibel an die Oberfläche eines festen Sorbens. Je stärker diese Bindung, desto stärker die Retention. Das wichtigste Adsorbens ist Kieselgel. Seine polaren Silanolgruppen binden polare Stoffe über Wasserstoffbrücken und Dipolkräfte (mehr dazu unter Normal- und Umkehrphasen).
Den Retentionsfaktor steuern hier vor allem zwei Größen. Die erste ist die Polarität der mobilen Phase. Ein polareres Fließmittel konkurriert stärker um die Bindungsstellen und verdrängt den Analyten schneller (siehe eluotrope Reihe). Die zweite ist die Aktivität der stationären Phase. Belegt Wasser die aktiven Zentren, sinkt sie. Ausgeheiztes, trockenes Kieselgel hält dagegen stärker zurück.
Ein Säulenschema mit mehreren Zeitpunkten liest man so: Die Bande, die zuerst das Säulenende erreicht, eluiert zuerst und wird am schwächsten zurückgehalten. Die Bande, die oben zurückbleibt, bindet fester an das Kieselgel.
Später eluiert heißt stärker retiniert und damit größere Affinität zur stationären Phase.
Säulenchromatographie lässt sich auch präparativ nutzen. So trennt man Verunreinigungen von einer Substanz ab, sammelt die Fraktionen und untersucht sie anschließend dünnschichtchromatographisch.
Verteilung
Bei der Verteilung haftet der Analyt nicht an einer Oberfläche. Er löst sich in zwei nicht mischbaren Phasen. Maßgeblich ist der Verteilungskoeffizient:
\[K = \frac{c_\mathrm{s}}{c_\mathrm{m}}\]
Dabei ist \(c_\mathrm{s}\) die Konzentration in der stationären und \(c_\mathrm{m}\) die in der mobilen Phase, jeweils in mol/L. Stoffe mit größerem \(K\) halten sich länger in der stationären Phase auf und eluieren später. Man kann sich die Säule wie eine Ausschüttelung vorstellen, die tausendfach hintereinander abläuft.
In der Gas-Flüssig-Chromatographie verteilt sich der Analyt zwischen dem Trägergas und einer flüssigen stationären Phase (Details unter Gaschromatographie). In der HPLC hängt \(K\) von der Polarität der mobilen Phase und der Polarität der stationären Phase ab. Entscheidend ist also, wie gut sich der gelöste Stoff in jeder Phase löst.
Andere Größen verändern \(K\) nicht. Der Dampfdruck der mobilen Phase ist in der flüssigen HPLC ohne Bedeutung. Die Kristallstruktur eines Arzneistoffs geht beim Auflösen verloren. Die Peakbreite ist eine Folge des Laufs und keine Ursache der Verteilung. Anders als bei der Adsorption ist die Aktivität der stationären Phase hier nicht die maßgebliche Stellgröße für den Retentionsfaktor.
Bindung an eine feste Oberfläche. Retention vor allem über Fließmittelpolarität und Aktivität des Sorbens steuerbar.
Lösung in zwei nicht mischbaren Phasen. Retention über den Verteilungskoeffizienten, bestimmt durch die Polarität beider Phasen.
Ionenaustausch und Größenausschluss
Beim Ionenaustausch trägt die stationäre Phase fest gebundene geladene Gruppen. Ein Kationenaustauscher besitzt etwa Sulfonatgruppen mit \(\ce{Na+}\) als Gegenion. Protonierte Basen verdrängen das \(\ce{Na+}\) und werden gebunden:
\[\ce{R-SO3^-Na+ + BH+ <=> R-SO3^-BH+ + Na+}\]
Getrennt wird also nach Ladung. Ob und wie stark ein Stoff geladen ist, hängt von seinem \(\mathrm{p}K_\mathrm{a}\)-Wert und vom pH der mobilen Phase ab. Deshalb lassen sich auch Stoffe mit unterschiedlichen \(\mathrm{p}K_\mathrm{a}\)-Werten trennen.
Beim Größenausschluss besteht die stationäre Phase aus porösen Partikeln. Kleine Moleküle dringen in die Poren ein und legen einen längeren Weg zurück. Große Moleküle passen nicht hinein, strömen außen vorbei und eluieren zuerst. Dieser Siebeffekt trennt nach Molekülgröße und damit näherungsweise nach Molekülmasse. Mehr dazu unter Ausschlusschromatographie.
Methodenwahl
Jedes Trennprinzip nutzt eine bestimmte Stoffeigenschaft. Für die Methodenwahl fragt man deshalb zuerst, worin sich zwei Stoffe unterscheiden.
| Trennprinzip | genutzte Eigenschaft | typischer Einsatz |
|---|---|---|
| Adsorption | Polarität | DC, Säule an Kieselgel |
| Verteilung | Löslichkeit in zwei Phasen | HPLC, GC |
| Ionenaustausch | Ladung, \(\mathrm{p}K_\mathrm{a}\) | Aminosäuren, Basen |
| Größenausschluss | Molekülgröße | Proteine, Polymere |
| Affinität | spezifische Bindung, etwa an Antikörper | Proteinreinigung |
| Chiralität | räumlicher Bau | Enantiomerentrennung |
Manche Größen klingen nach Trennparameter, trennen aber nicht. Extinktionskoeffizienten betreffen nur die Detektion. Normalpotentiale gehören zur Elektrochemie. Diffusion findet in jeder Säule statt, auch an unpolaren Phasen. Sie verbreitert die Peaks, trägt aber nichts zur Trennung bei (siehe van-Deemter-Gleichung). Auch unterschiedliches Beschleunigungsverhalten oder eine unterschiedliche maximale Fließgeschwindigkeit trennt nicht. Alle Analyten reisen mit derselben mobilen Phase, verschieden ist nur ihre Verweildauer in der stationären Phase.
Ein typisches Beispiel sind Hydrocortison und Prednisolon. Beide sind neutral und nicht ionisierbar, Ionenaustausch hilft also nicht. Sie sind fast gleich groß, daher scheidet auch Größenausschluss aus. Sie unterscheiden sich nur durch die Δ1-Doppelbindung des Prednisolons. Diese ändert Polarität und Form leicht. Getrennt werden beide deshalb über Polaritätsunterschiede, etwa per HPLC.
Für ein beliebiges Substanzpaar geht man so vor:
- Ladung prüfen: Sind die Stoffe ionisierbar mit verschiedenen \(\mathrm{p}K_\mathrm{a}\)-Werten, eignet sich Ionenaustausch.
- Größe prüfen: Unterscheiden sie sich stark in der Molekülgröße, eignet sich Größenausschluss.
- Chiralität prüfen: Enantiomere brauchen ein chirales Trennsystem.
- Polarität nutzen: Bleibt nur ein Polaritätsunterschied, wählt man Adsorption oder Verteilung.
Quiz
Aussage 1
In der Größenausschlusschromatographie verlassen große Moleküle die Säule vor kleinen.
Große Moleküle passen nicht in die Poren, strömen außen vorbei und eluieren zuerst.
Aussage 2
Hydrocortison und Prednisolon lassen sich gut an einem Ionenaustauscher trennen, weil sie sich in ihrer Ladung unterscheiden.
Beide sind neutral und nicht ionisierbar. Sie werden über Polaritätsunterschiede getrennt, etwa per HPLC.
Aussage 3
Auch an unpolaren stationären Phasen findet Diffusion statt, sie ist jedoch kein chromatographischer Trennmechanismus.
Diffusion tritt in jeder Säule auf und verbreitert die Peaks, trennt aber nicht.
Aussage 4
Bei einer Säulentrennung an Kieselgel hat die zuletzt eluierte Substanz die geringste Affinität zur stationären Phase.
Die später eluierte Substanz wird stärker zurückgehalten und hat die größere Affinität zum Kieselgel.
Aussage 5
Der Verteilungskoeffizient eines Arzneistoffs in der HPLC steigt mit dem Dampfdruck der mobilen Phase.
Der Dampfdruck spielt keine Rolle. Der Verteilungskoeffizient hängt von der Polarität der mobilen und der stationären Phase ab.
Aussage 6
In der Adsorptionschromatographie lässt sich die Retention über den Wassergehalt und damit die Aktivität des Kieselgels beeinflussen.
Wasser belegt aktive Zentren und senkt die Aktivität; neben der Fließmittelpolarität ist die Aktivität die wichtigste Einflussgröße.
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