Qualitative und quantitative Auswertung
Wie man aus einem Chromatogramm Identität und Menge eines Stoffes abliest und warum Peakhöhen von Retention und Detektionswellenlänge abhängen.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Peakfläche ist die Fläche zwischen Peak und Basislinie und das Maß für die Stoffmenge, die Retentionszeit dient der Identifizierung.
- Näherungsweise ergibt sich die Fläche aus Peakhöhe × Halbwertsbreite, bei symmetrischen GC-Peaks reicht die Peakhöhe; Produkte oder Quotienten mit der Retentionszeit sind kein Mengenmaß.
- Längere Retention oder niedrigere GC-Säulentemperatur machen Peaks breiter und niedriger, die Fläche bleibt gleich.
- Geringeres Injektionsvolumen oder Verdünnung senken alle Peakhöhen proportional, ihr Verhältnis bleibt.
- Bei UV-Detektion hängt die Peakhöhe vom Chromophor ab: Progesteron (Enon) dominiert bei 240 nm, Estradiol (Phenolring) bei 280 nm.
- Deckungsgleiche Peaks unterschiedlicher Höhe im Photodiodenarray-Overlay sind Spuren einer Substanz bei mehreren Wellenlängen.
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Worum es geht
Ein Chromatogramm sagt zweierlei: welcher Stoff eluiert und wie viel davon vorliegt. Für Gehaltsbestimmungen und Reinheitsprüfungen von Arzneistoffen muss man beides sicher auseinanderhalten. Außerdem muss man wissen, welche Peakgröße sich als Mengenmaß eignet.
Peakfläche und Peakhöhe
Die Retentionszeit zeigt, welcher Stoff eluiert. Sie dient der qualitativen Auswertung. Wie man sie abliest, steht unter Chromatogramm und Retentionszeiten. Die Menge des Stoffes zeigt dagegen die Peakfläche.
Die Peakfläche ist die Fläche zwischen Peakkurve und Basislinie. Sie ist der Stoffmenge proportional, die den Peak erzeugt, und damit das Maß der quantitativen Auswertung.
Die Software integriert die Fläche direkt. Von Hand nähert man sie über das Produkt aus Peakhöhe und Halbwertsbreite an, also \(h \cdot b_{0,5}\). Bei einem Gauß-Peak ist dieses Rechteck der wahren Fläche proportional. Die Fläche beträgt etwa \(1{,}06 \cdot h \cdot b_{0,5}\).
Andere Kombinationen taugen nicht. Halbwertsbreite × Basisbreite beschreibt nur die Form und enthält keine Höhe. Sobald die Retentionszeit als Faktor oder Teiler auftaucht, misst man die Lage des Peaks mit. Die Lage hat mit der Menge nichts zu tun. Deshalb sind Retentionszeit × Basisbreite oder Halbwertsbreite/Retentionszeit kein Mengenmaß. Auch Peakbreite × Retentionszeit ist der Stoffmenge nicht proportional.
Bei symmetrischen Peaks genügt im Gaschromatogramm sogar die Peakhöhe allein als Näherung. Das gilt, solange die verglichenen Peaks gleich breit bleiben.
Fläche und Retention
Je länger ein Stoff auf der Säule bleibt, desto stärker läuft seine Zone auseinander. Die Ursachen beschreibt die Lerneinheit zur Peakverbreiterung. Der Peak wird breiter und niedriger. Die Stoffmenge bleibt gleich und damit auch die Fläche. Man kann sich das wie einen Sandhaufen vorstellen, der flacher wird, ohne Sand zu verlieren. Die Peakfläche ist deshalb weitgehend unabhängig von der Retentionszeit.
In der HPLC nehmen die Peaks mit wachsender Retentionszeit an Breite zu und an Höhe ab. In der GC wirkt die Temperatur. Senkt man die Säulentemperatur, eluieren die Stoffe später, und ihre Peaks werden breiter und flacher. Beim Wechsel von isothermer Elution zum Temperaturgradienten werden späte Peaks wieder schmal und hoch. Das Verhältnis der Peakflächen zweier Komponenten bleibt dabei weitgehend konstant.
Niedrigere Peaks bei gleicher Probe und längerer Retention beruhen also auf der Verbreiterung. Auf ein kleineres Injektionsvolumen oder eine schwächere Detektorempfindlichkeit kann man daraus nicht schließen. Maßgeblich bleibt die Fläche. Injiziert man weniger derselben Lösung oder verdünnt man die Probe, sinken alle Peakhöhen proportional. Ihr Verhältnis zueinander ändert sich nicht.
Detektionswellenlänge
Bei UV-Detektion entspricht die Peakhöhe, gemessen von der Basislinie bis zur Spitze, der Signalintensität. Sie hängt davon ab, wie stark der Analyt bei der eingestellten Wellenlänge absorbiert. Entscheidend ist sein Chromophor. Zwei Stoffe gleicher Konzentration können daher sehr unterschiedlich hohe Peaks liefern.
Ein Beispiel ist das Steroidpaar Progesteron und Estradiol. Progesteron trägt ein α,β-ungesättigtes Keton (Enon) und absorbiert stark um 240 nm. Estradiol besitzt einen aromatischen Phenolring A, der um 280 nm absorbiert. Misst man dieselbe Lösung bei beiden Wellenlängen, kehrt sich das Peakhöhenverhältnis um.
So ordnet man Chromatogramme den Wellenlängen zu:
- Chromophore suchen: In den Strukturformeln Enon, Aromat oder andere konjugierte Systeme markieren.
- Absorption zuordnen: Für jeden Chromophor die Wellenlänge starker Absorption festhalten.
- Peaks vergleichen: Das Chromatogramm, in dem ein Stoff dominiert, gehört zur Wellenlänge seines Chromophors.
- Umkehr deuten: Kehrt sich das Höhenverhältnis bei derselben Lösung um, wurde die Wellenlänge gewechselt und nicht die Konzentration.
Ein Photodiodenarray-Detektor registriert mehrere Wellenlängen gleichzeitig (siehe HPLC-Detektoren). Im Overlay liegen dann deckungsgleiche Peaks gleicher Retentionszeit und Form übereinander, nur unterschiedlich hoch. Das sind Spuren einer einzigen Substanz bei verschiedenen Wellenlängen. Verschiedene Stoffe überlagern sich hier nicht. Ein solches Chromatogramm ist auswertbar.
Bei der Standardaddition misst man die Probe mehrmals getrennt, jeweils mit zugesetztem Standard. Übereinanderliegende Peaks gleicher Retentionszeit in einem einzigen Chromatogramm entstehen dabei nicht.
Quiz
Aussage 1
Wird nur die Hälfte derselben Lösung injiziert, ändert sich das Verhältnis der Peakhöhen zweier Komponenten.
Alle Peakhöhen sinken proportional. Ihr Verhältnis zueinander bleibt gleich.
Aussage 2
Das Produkt aus Retentionszeit und Basisbreite eines Peaks ist der Stoffmenge proportional und eignet sich zur quantitativen Auswertung.
Die Retentionszeit beschreibt die Lage des Peaks, nicht die Menge. Quantitativ wertet man über die Peakfläche oder näherungsweise über Peakhöhe × Halbwertsbreite aus.
Aussage 3
Senkt man in der GC die Säulentemperatur, werden die Peaks einer Probe breiter und niedriger, während ihre Flächen weitgehend gleich bleiben.
Die Stoffe eluieren später, ihre Zonen verbreitern sich. Die Stoffmenge und damit die Fläche ändern sich nicht.
Aussage 4
Drei deckungsgleiche Peaks gleicher Retentionszeit, aber unterschiedlicher Höhe in einem Photodiodenarray-Chromatogramm stammen von einer Substanz, die bei drei Wellenlängen registriert wurde.
Der Detektor zeichnet mehrere Wellenlängen gleichzeitig auf. Die Höhen unterscheiden sich, weil die Substanz bei jeder Wellenlänge anders stark absorbiert.
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