Direkte und indirekte Enantiomerentrennung
Wie man Enantiomere trennt: direkt über eine chirale Umgebung im Trennsystem, indirekt nach Umsetzung zu Diastereomeren und präparativ über diastereomere Salze.
Das Wichtigste in Kürze
- Enantiomerentrennung gelingt nur mit einem enantiomerenreinen chiralen Partner, der aus gleichen Enantiomeren unterscheidbare Diastereomere oder diastereomere Assoziate macht.
- Bei der direkten Trennung bildet eine chirale stationäre Phase oder ein chiraler Zusatz der mobilen Phase diastereomere Komplexe; an unbehandeltem Kieselgel werden Enantiomere gleich stark adsorbiert.
- Enantiomere kleiner Moleküle lassen sich direkt per GC an chiralen Kapillarsäulen und per DC trennen; Polarimetrie, Polarographie und Ultrazentrifugation trennen keine Enantiomere.
- Bei der indirekten Trennung wird das Racemat über eine funktionelle Gruppe mit einem enantiomerenreinen Derivatisierungsreagenz umgesetzt, und die Diastereomere werden an einer achiralen Phase getrennt; das Reagenz kann zusätzlich einen Fluorophor tragen.
- Über diastereomere Salze und fraktionierende Kristallisation trennt man Ibuprofen mit (R)- oder (S)-1-Phenylethylamin und das sekundäre Amin Fluoxetin mit L-(+)- oder D-(−)-Weinsäure.
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Worum es geht
Viele Arzneistoffe sind chiral, und ihre Enantiomere wirken oft verschieden stark. Beim Ibuprofen etwa ist die (S)-Form die eigentliche Wirkform. Für Reinheitsprüfung, Pharmakokinetik und Herstellung muss man Enantiomere deshalb trennen können: chromatographisch auf zwei Wegen, präparativ zusätzlich durch Kristallisation.
Enantiomere und Diastereomere
Enantiomere verhalten sich wie Bild und Spiegelbild. In achiraler Umgebung stimmen sie in allen physikalischen und chemischen Eigenschaften überein. Schmelzpunkt, Löslichkeit, Polarität und \(pK_s\)-Wert sind identisch. Nur die Drehrichtung von linear polarisiertem Licht unterscheidet sie, wie in Enantiomere und Diastereomere im Polarimeter beschrieben.
Für eine gewöhnliche stationäre Phase sind beide Enantiomere deshalb gleich. Sie werden gleich stark zurückgehalten und eluieren als ein gemeinsamer Peak. Die chromatographischen Trennprinzipien allein reichen also nicht aus.
Diastereomere sind Stereoisomere, die keine Spiegelbilder sind. Ihre Gruppen liegen in anderen Abständen zueinander. Sie unterscheiden sich daher in Polarität, Löslichkeit und Adsorption und lassen sich wie zwei verschiedene Verbindungen trennen.
Daraus folgt das Grundprinzip jeder Enantiomerentrennung. Aus einem Paar gleicher Partner muss ein Paar ungleicher werden. Das gelingt nur mit einem zweiten, enantiomerenreinen chiralen Partner. Man kann sich das wie einen rechten Handschuh vorstellen: Zwei Hände sehen gleich aus, aber nur die rechte passt hinein. Drei Wege nutzen dieses Prinzip:
- direkt: Eine chirale Umgebung im Trennsystem bildet kurzlebige diastereomere Assoziate.
- indirekt: Eine Reaktion vor der Trennung erzeugt stabile, kovalent gebundene Diastereomere.
- präparativ über Salze: Diastereomere Salze werden durch Kristallisation getrennt, ganz ohne Chromatographie.
Direkte Trennung
Bei der direkten Enantiomerentrennung gibt man das Racemat unverändert auf. Die chirale Information steckt im Trennsystem selbst. Üblicherweise sitzt sie in der stationären Phase.
Eine chirale stationäre Phase trägt einen enantiomerenreinen Selektor, der an das Trägermaterial gebunden oder darauf beschichtet ist. Sie bildet mit den beiden Enantiomeren unterschiedlich stabile diastereomere Assoziate und hält sie deshalb unterschiedlich lange zurück.
Die Assoziate entstehen reversibel über Wasserstoffbrücken, π-π-Wechselwirkungen, Dipolkräfte oder durch Einlagerung in Hohlräume. Weil sie diastereomer sind, unterscheiden sich ihre Stabilitätskonstanten. Das stärker gebundene Enantiomer verweilt länger an der Phase und eluiert später. Typische Selektoren sind Cyclodextrine, Cellulose- und Amylosederivate, Proteine und Aminosäurederivate.
Warum braucht es dafür eine bestimmte Geometrie? Das erklärt das Drei-Punkt-Modell. Der Selektor muss an mindestens drei Stellen gleichzeitig mit dem Analyten wechselwirken. Ein Enantiomer erreicht alle drei Kontaktstellen, sein Spiegelbild höchstens zwei. Mit nur zwei Kontaktpunkten würden beide Enantiomere gleich gut binden.
Der chirale Partner kann auch aus der mobilen Phase kommen. Man setzt dem Fließmittel einen chiralen Zusatz zu, etwa ein Cyclodextrin oder einen Kupfer(II)-Komplex einer L-Aminosäure. Schon in Lösung bilden sich dann diastereomere Komplexe. Sie verteilen sich unterschiedlich zwischen den Phasen, sodass eine gewöhnliche achirale Säule genügt.
Die Grenze dieses Ansatzes wird im Examen gerne gefragt: Unbehandeltes Kieselgel ist achiral und adsorbiert beide Enantiomere gleich stark. Ein chiraler Selektor in der stationären oder mobilen Phase muss also immer hinzukommen.
Die direkte Trennung ist nicht auf die HPLC beschränkt. Enantiomere kleiner, flüchtiger Moleküle trennt man gaschromatographisch an Kapillarsäulen mit derivatisierten Cyclodextrinen oder Aminosäurederivaten wie Chirasil-Val. Auch die Dünnschichtchromatographie gelingt, zum Beispiel an Platten für den Ligandenaustausch mit Kupfer(II)-Ionen und einem chiralen Aminosäurederivat. Die Enantiomerentrennung in der Kapillarelektrophorese folgt demselben Prinzip und wird dort behandelt.
Manche Verfahren klingen nach Stereochemie, trennen aber nichts. Die Polarimetrie misst nur den Drehwinkel der gesamten Probe. Die Polarographie ist ein elektrochemisches Verfahren an der Quecksilbertropfelektrode. Sie unterscheidet Stoffe nach ihrem Reduktionspotential, und das ist bei Enantiomeren gleich. Auch die Ultrazentrifugation versagt, denn sie trennt nach Masse und Dichte, die bei Spiegelbildern identisch sind.
Indirekte Trennung
Die indirekte Enantiomerentrennung verlegt die chirale Information in einen Reaktionsschritt vor der Chromatographie. Man setzt den racemischen Arzneistoff mit einem enantiomerenreinen Reagenz um. Aus den beiden Enantiomeren entstehen zwei Diastereomere.
Ein chirales Derivatisierungsreagenz ist eine enantiomerenreine Verbindung mit einer reaktiven Gruppe, die mit einer funktionellen Gruppe des Analyten eine kovalente Bindung knüpft. Sein Stereozentrum bleibt dabei unverändert und macht aus jedem Enantiomer ein eigenes Diastereomer.
Die Reaktion nutzt die Reaktivität funktioneller Gruppen des Arzneistoffs. Amine reagieren mit Säurechloriden zu Amiden oder mit Chlorformiaten zu Carbamaten. Carbonsäuren setzt man mit chiralen Aminen zu Amiden um, Alkohole mit Säurechloriden zu Estern. Ein racemisches Amin liefert mit einem (S)-Säurechlorid zwei Amide:
\[(R)\text{-Amin} + (S)\text{-Säurechlorid} \longrightarrow (R,S)\text{-Amid} + \ce{HCl}\]
\[(S)\text{-Amin} + (S)\text{-Säurechlorid} \longrightarrow (S,S)\text{-Amid} + \ce{HCl}\]
Das (R,S)- und das (S,S)-Amid sind keine Spiegelbilder, denn das Spiegelbild von (R,S) wäre (S,R). Form und Polarität der beiden Amide unterscheiden sich. Deshalb trennt sie eine gewöhnliche achirale Phase wie eine Umkehrphase RP-18. Eine chirale stationäre Phase ist nicht erforderlich.
Ein Examensklassiker: Das Racemat wird vor der Trennung mit einem enantiomerenreinen Reagenz über eine funktionelle Gruppe derivatisiert, und die Säule trennt dann Diastereomere, typischerweise an einer achiralen stationären Phase. Achte darauf, dass hier gerade keine chirale Phase nötig ist und nicht die Enantiomere selbst getrennt werden.
Damit das Peakverhältnis das ursprüngliche Enantiomerenverhältnis richtig wiedergibt, müssen einige Voraussetzungen erfüllt sein:
- Der Analyt trägt eine reaktive funktionelle Gruppe, etwa eine Amino-, Hydroxy- oder Carboxygruppe.
- Das Reagenz ist enantiomerenrein.
- Die Umsetzung verläuft vollständig, und beide Enantiomere reagieren gleich schnell.
- Unter den Reaktionsbedingungen tritt keine Racemisierung auf.
Enthält das (S)-Reagenz Spuren des (R)-Reagenz, entsteht aus dem (R)-Amin auch (R,R)-Amid. Es ist das Spiegelbild des (S,S)-Amids und eluiert an achiraler Phase mit ihm zusammen, sodass das gemessene Verhältnis verfälscht ist.
Das Reagenz kann eine zweite Aufgabe übernehmen. Trägt es zusätzlich einen Fluorophor, wird das Derivat fluoreszenzaktiv und lässt sich in Spuren nachweisen. Ein Beispiel ist FLEC, 1-(9-Fluorenyl)ethylchlorformiat, das in beiden enantiomerenreinen Formen erhältlich ist. Es setzt Amine zu fluoreszierenden Carbamaten um. So lassen sich Enantiomere auch in geringen Konzentrationen im Plasma bestimmen.
- Racemat wird unverändert aufgegeben
- chiraler Selektor in stationärer oder mobiler Phase
- getrennt werden Enantiomere über kurzlebige Assoziate
- Racemat wird vorher derivatisiert
- chirale Information im enantiomerenreinen Reagenz
- getrennt werden stabile Diastereomere an achiraler Phase
Diastereomere Salze
Für die Gewinnung reiner Enantiomere im größeren Maßstab nutzt man oft ein klassisches Verfahren ohne Chromatographie. Eine racemische Säure bildet mit einer enantiomerenreinen Base zwei diastereomere Salze. Umgekehrt gilt das Gleiche für eine racemische Base und eine enantiomerenreine Säure. Die beiden Salze unterscheiden sich in ihrer Löslichkeit.
Bei der fraktionierenden Kristallisation fällt das schwerer lösliche Salz zuerst aus. Man filtriert es ab und setzt den Arzneistoff mit Säure oder Lauge wieder frei. Das leichter lösliche Salz bleibt in der Mutterlauge.
Zwei Beispiele zeigen die Logik. Ibuprofen ist eine chirale Carbonsäure. Sein Racemat trennt man mit einer chiralen Base, nämlich (R)- oder (S)-1-Phenylethylamin. Fluoxetin ist dagegen eine chirale Base. Für sein Racemat nimmt man eine chirale Säure, nämlich L-(+)- oder D-(−)-Weinsäure.
Welches Enantiomer des Hilfsstoffs man wählt, ist grundsätzlich gleichgültig. Mit dem Gegenenantiomer kehren sich nur die Löslichkeitsverhältnisse um. Dann kristallisiert eben das andere Enantiomer des Arzneistoffs zuerst aus.
Ob ein Arzneistoff sich so trennen lässt, liest man an der Strukturformel ab. Am Fluoxetin geht man so vor:
- Stereozentrum suchen: Gesucht ist ein \(sp^3\)-C-Atom mit vier verschiedenen Substituenten. Bei Fluoxetin ist das C-3 mit H, Phenylring, 4-(Trifluormethyl)phenoxy-Gruppe und der Kette zum Stickstoff.
- Salzbildende Gruppe suchen: Die Gruppe \(\ce{-NH-CH3}\) ist ein sekundäres Amin. Es ist basisch und wird von Carbonsäuren protoniert.
- Partner wählen: Eine chirale Base braucht eine enantiomerenreine Säure, hier Weinsäure. Eine chirale Säure wie Ibuprofen braucht eine enantiomerenreine Base wie 1-Phenylethylamin.
Das Prinzip entspricht der indirekten Chromatographie. Auch hier macht ein enantiomerenreiner Partner aus Enantiomeren Diastereomere. Der Unterschied liegt in der Bindung: Statt einer kovalenten Bindung entsteht ein Salz, das sich später leicht wieder spalten lässt.
Quiz
Aussage 1
Ein chirales Derivatisierungsreagenz wie FLEC kann zusätzlich einen Fluorophor tragen und so den empfindlichen Fluoreszenznachweis der Derivate ermöglichen.
FLEC setzt Amine zu fluoreszierenden Carbamaten um und verbindet so Derivatisierung und empfindliche Detektion.
Aussage 2
Racemisches Ibuprofen trennt man durch fraktionierende Kristallisation seiner diastereomeren Salze mit L-(+)-Weinsäure.
Ibuprofen ist eine Carbonsäure und braucht eine chirale Base, etwa (R)- oder (S)-1-Phenylethylamin. Weinsäure dient zur Trennung chiraler Basen wie Fluoxetin.
Aussage 3
Enantiomere kleiner, flüchtiger Moleküle lassen sich gaschromatographisch an Kapillarsäulen mit chiralen Selektoren wie derivatisierten Cyclodextrinen trennen.
Die direkte Enantiomerentrennung funktioniert auch in der GC, ebenso in der DC.
Aussage 4
Die beiden Enantiomere eines Racemats werden an unbehandeltem Kieselgel unterschiedlich stark adsorbiert und lassen sich daher dort trennen.
Unbehandeltes Kieselgel ist achiral und adsorbiert beide Enantiomere gleich stark. Für eine direkte Trennung braucht man einen chiralen Selektor in der stationären oder mobilen Phase.
Aussage 5
Ein chiraler Zusatz zum Fließmittel kann eine Enantiomerentrennung an einer achiralen Säule ermöglichen.
Der Zusatz bildet schon in Lösung diastereomere Komplexe, die sich unterschiedlich zwischen den Phasen verteilen.
Aussage 6
Die indirekte Enantiomerentrennung setzt zwingend eine chirale stationäre Phase voraus.
Die chirale Information steckt im enantiomerenreinen Derivatisierungsreagenz. Die entstehenden Diastereomere trennt man typischerweise an einer achiralen Phase wie RP-18.
Aussage 7
Mit der Polarimetrie lassen sich die beiden Enantiomere eines Racemats voneinander trennen.
Die Polarimetrie misst nur den Drehwinkel der gesamten Probe. Getrennt wird dabei nichts.
Aussage 8
Bei der indirekten Enantiomerentrennung trennt die chromatographische Säule Diastereomere und nicht die Enantiomere selbst.
Die Enantiomere werden vorher mit einem enantiomerenreinen Reagenz in Diastereomere überführt, und diese werden getrennt.
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