Auflösung und Peak-Tal-Verhältnis
Wie man die Trennung zweier Peaks mit der Auflösung \(R_s\) berechnet und beurteilt und wann stattdessen das Peak-Tal-Verhältnis eingesetzt wird.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Auflösung \(R_s\) ist das Maß für die Güte der Trennung zweier Peaks und wird aus der Differenz der Retentionszeiten und der Summe der Peakbreiten berechnet.
- Mit Halbwertsbreiten gilt \(R_s = 1{,}18\,(t_{R2}-t_{R1})/(w_{h1}+w_{h2})\), mit Basisbreiten steht der Faktor 2 statt 1,18.
- Die Peakhöhe geht nicht in die Auflösung ein, und \(R_s\) ist keine reine Säulenkenngröße, weil es vom Substanzpaar abhängt.
- Basislinientrennung liegt ab \(R_s = 1{,}5\) vor, bei \(R_s = 1{,}0\) ist das Tal zwischen den Peaks noch nicht auf der Basislinie.
- Das Peak-Tal-Verhältnis \(p/v = H_p/H_v\) nutzt die Höhe des kleineren Peaks und des Talpunkts über der extrapolierten Basislinie.
- \(p/v\) hängt von den Konzentrationen von Haupt- und Nebenkomponente ab und ist der Auflösung nicht direkt proportional.
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Worum es geht
Ein Chromatogramm ist nur so viel wert wie die Trennung seiner Peaks. Die Auflösung beschreibt in einer Zahl, wie sauber zwei benachbarte Substanzen getrennt sind. Für kleine Nebenpeaks auf der Flanke eines Hauptpeaks dient das Peak-Tal-Verhältnis. Beide Größen braucht man, um Reinheitsprüfungen und Gehaltsbestimmungen per HPLC zu bewerten.
Definition und Berechnung
Eine Trennung ist gut, wenn zwei Peaks weit auseinanderliegen und zugleich schmal sind. Die Auflösung \(R_s\) fasst beides in einer Zahl zusammen. Sie ist das Maß für die Güte der Trennung zweier Substanzen. Im Zähler steht der Abstand der Peakmaxima, im Nenner die Summe der Peakbreiten. Wie man Retentionszeiten und Peakbreiten abliest, steht unter Chromatogramm und Retentionszeiten.
\[R_s = \frac{1{,}18\,(t_{R2}-t_{R1})}{w_{h1}+w_{h2}} \qquad R_s = \frac{2\,(t_{R2}-t_{R1})}{w_{01}+w_{02}}\]
| Größe | Bedeutung | Einheit |
|---|---|---|
| \(R_s\) | Auflösung | dimensionslos |
| \(t_{R1}\), \(t_{R2}\) | Retentionszeiten des früher und des später eluierenden Peaks | min oder s |
| \(w_{h1}\), \(w_{h2}\) | Peakbreiten in halber Höhe (Halbwertsbreiten) | min oder s |
| \(w_{01}\), \(w_{02}\) | Basisbreiten zwischen den Schnittpunkten der Wendetangenten mit der Basislinie | min oder s |
Beide Formeln liefern für Gauß-Peaks dasselbe Ergebnis. Die Basisbreite ist etwa 1,7-mal so groß wie die Halbwertsbreite. Aus dem Faktor 2 wird deshalb 2/1,7 ≈ 1,18. Das Arzneibuch verwendet die Fassung mit Halbwertsbreiten, denn die halbe Höhe lässt sich einfacher und genauer bestimmen als die Wendetangenten.
Was die Formel aussagt
Man kann sich zwei Peaks wie zwei Hügel vorstellen. Sie bleiben als zwei Hügel erkennbar, wenn sie weit auseinanderstehen oder steil und schmal sind. Daraus folgen die Proportionalitäten: Doppelter Abstand der Maxima bei gleichen Breiten bedeutet doppelte Auflösung. Halbierte Peakbreiten bei gleichem Abstand bedeuten ebenfalls doppelte Auflösung. Im Grenzfall gleicher Retentionszeiten ist \(R_s = 0\), die Substanzen koeluieren.
In die Auflösung gehen nur Retentionszeiten und Peakbreiten ein. Die Peakhöhe spielt keine Rolle. Ob man Gesamt- oder Nettoretentionszeiten einsetzt, ist gleich. Bei der Differenz fällt die Totzeit heraus. Wichtig ist die Differenz, nicht der Quotient. Den Quotienten der Nettoretentionszeiten nennt man Trennfaktor \(\alpha\), erklärt unter Retentionsfaktor und Trennfaktor.
Die Auflösung ist keine reine Kenngröße der Säule. Dieselbe Säule trennt ein Substanzpaar gut und ein anderes schlecht, denn \(R_s\) hängt vom jeweiligen Substanzpaar ab. Die Leistung der Säule selbst beschreibt die Trennstufenzahl. Die Auflösung lässt sich auch über Retentionsfaktoren, Trennfaktor und Trennstufenzahl ausdrücken. Diesen Zusammenhang behandelt die Auflösungsgleichung.
Aus demselben Chromatogramm berechnet man oft zusätzlich den Retentionsfaktor. Dazu liest man die Totzeit \(t_M\) ab und rechnet \(k = (t_R - t_M)/t_M\).
Rechenbeispiel
Zwei Peaks eines HPLC-Chromatogramms sollen bewertet werden. Gegeben sind ihre Retentionszeiten und Halbwertsbreiten.
- Ablesen: \(t_{R1} = 4{,}8\) min, \(t_{R2} = 5{,}6\) min, \(w_{h1} = 0{,}25\) min, \(w_{h2} = 0{,}29\) min.
- Abstand: \(t_{R2}-t_{R1} = 0{,}8\) min. Mal 1,18 ergibt 0,944 min.
- Breitensumme: 0,25 min + 0,29 min = 0,54 min.
- Dividieren: \(R_s = 0{,}944/0{,}54 \approx 1{,}75\). Die Einheiten kürzen sich heraus.
- Beurteilen: 1,75 liegt über 1,5. Die Peaks sind basisliniengetrennt.
Zur Kontrolle mit Basisbreiten von 0,42 min und 0,49 min: \(R_s = 2 \cdot 0{,}8/0{,}91 \approx 1{,}76\). Beide Wege stimmen überein.
Der Faktor 1,18 gehört zu den Halbwertsbreiten, der Faktor 2 zu den Basisbreiten. Alle Zeiten müssen in derselben Einheit stehen, also nicht Minuten mit Sekunden mischen.
Die Berechnung von \(R_s\) aus zwei Retentionszeiten und Halbwertsbreiten mit dem Faktor 1,18 ist ein Examensklassiker. Achte darauf, die Differenz der Retentionszeiten durch die Summe der Breiten zu teilen und das Ergebnis mit 1,5 zu vergleichen. Die Peakhöhe gehört nicht in die Rechnung.
Basislinientrennung
Die Zahl \(R_s\) allein sagt noch wenig. Erst ein Grenzwert macht sie zum Urteil über die Trennung. Entscheidend ist, ob das Signal zwischen zwei Peaks wieder bis auf die Basislinie zurückgeht.
Zwei Peaks sind basisliniengetrennt, wenn das Detektorsignal zwischen ihnen die Basislinie erreicht. Das ist ab einer Auflösung von \(R_s = 1{,}5\) der Fall.
Die Abbildung zeigt Peakpaare gleicher Breite mit wachsender Auflösung. Bei \(R_s = 0{,}5\) erscheint der zweite Peak nur als Schulter. Bei \(R_s = 1{,}0\) sind zwei Maxima mit einem flachen Tal zu sehen. Das Tal reicht aber nicht bis zur Basislinie, es liegt also keine Basislinientrennung vor. Die Peaks überlappen noch um einige Prozent ihrer Fläche.
Ab \(R_s = 1{,}5\) kehrt das Signal zwischen den Peaks auf die Basislinie zurück. Bei \(R_s = 2{,}0\) ist die Basislinientrennung sicher erreicht und es bleibt Abstand. Der Übergang von überlappenden zu basisliniengetrennten Peaks bedeutet also immer eine höhere Auflösung. Für die Quantifizierung zählt das, denn überlappende Flächen verfälschen das Ergebnis.
Der Grenzwert 1,5 gilt streng für ähnlich große Peaks. Sitzt ein kleiner Nebenpeak auf der Flanke eines großen Hauptpeaks, ist Basislinientrennung oft nicht erreichbar. Seine Halbwertsbreite lässt sich dann kaum messen. Für diesen Fall gibt es eine eigene Kenngröße.
Peak-Tal-Verhältnis
Das Peak-Tal-Verhältnis \(p/v\) (peak-to-valley ratio) charakterisiert die Trennung zweier Peaks ohne Basislinientrennung. Typisch ist eine kleine Verunreinigung direkt neben dem Hauptpeak eines Arzneistoffs. Das Arzneibuch nutzt \(p/v\) deshalb in manchen Reinheitsmonographien als Mindestanforderung an die Trennung.
Man verlängert zuerst die Basislinie unter dem Peakpaar gestrichelt, die extrapolierte Basislinie. Von ihr aus misst man zwei Höhen:
- \(H_p\): Höhe des kleineren Peaks über der extrapolierten Basislinie
- \(H_v\): Höhe des niedrigsten Punkts zwischen den beiden Peaks über der extrapolierten Basislinie
- Das Verhältnis ist \(p/v = H_p/H_v\).
Welche Höhen eingehen, wird im Examen gerne gefragt: die des kleineren Peaks und die des Talpunkts, beide über der extrapolierten Basislinie. Die Höhe des größeren Peaks geht nicht ein, ebenso wenig die Trennstufenhöhe. Je tiefer das Tal, desto kleiner wird \(H_v\) und desto größer \(p/v\). Ein großer Wert bedeutet also eine gute Trennung.
Anders als die Auflösung hängt das Peak-Tal-Verhältnis von den Konzentrationen von Haupt- und Nebenkomponente ab. Bei gleicher Säule und gleichem Abstand ändert sich \(H_p\) mit der Menge der Nebenkomponente. Die Talhöhe \(H_v\) wird dagegen stark von der Flanke des Hauptpeaks bestimmt. Deshalb sind \(p/v\) und \(R_s\) nicht direkt proportional zueinander.
Auflösung: Zeiten und Breiten, unabhängig von der Peakhöhe. Peak-Tal-Verhältnis: nur Höhen, kleiner Peak durch Tal, abhängig von den Konzentrationen.
Quiz
Aussage 1
Die Auflösung beschreibt allein die Leistung der Säule und ist für jedes Substanzpaar auf derselben Säule gleich.
\(R_s\) hängt vom Substanzpaar ab. Die Säulenleistung beschreibt die Trennstufenzahl.
Aussage 2
Bei einer Auflösung von 1,0 erreicht das Signal zwischen zwei gleich großen Peaks bereits die Basislinie.
Bei \(R_s = 1{,}0\) sind zwei Maxima mit flachem Tal sichtbar, aber ohne Basislinientrennung. Diese beginnt erst bei 1,5.
Aussage 3
Mit Halbwertsbreiten berechnet man die Auflösung als 1,18-fache Differenz der Retentionszeiten geteilt durch die Summe der beiden Halbwertsbreiten.
Das ist die Arzneibuch-Formel \(R_s = 1{,}18\,(t_{R2}-t_{R1})/(w_{h1}+w_{h2})\).
Aussage 4
Die Auflösung entspricht dem Quotienten der Nettoretentionszeiten zweier Substanzen.
Dieser Quotient ist der Trennfaktor \(\alpha\). Die Auflösung nutzt die Differenz der Retentionszeiten, bezogen auf die Peakbreiten.
Aussage 5
Ändert sich die Konzentration der Nebenkomponente, kann sich das Peak-Tal-Verhältnis bei gleicher Säule ändern.
\(p/v\) hängt von den Konzentrationen von Haupt- und Nebenkomponente ab, weil \(H_p\) mit der Menge der Nebenkomponente wächst.
Aussage 6
Ein höherer Peak verbessert bei gleichen Retentionszeiten und Breiten die berechnete Auflösung.
Die Peakhöhe geht nicht in \(R_s\) ein. Nur Retentionszeiten und Peakbreiten zählen.
Aussage 7
Für das Peak-Tal-Verhältnis misst man die Höhe des kleineren Peaks und die Höhe des tiefsten Punkts zwischen beiden Peaks, jeweils über der extrapolierten Basislinie.
\(p/v = H_p/H_v\). Die Höhe des größeren Peaks geht nicht ein.
Aussage 8
Zwei Peaks mit \(R_s = 1{,}6\) gelten als basisliniengetrennt.
Basislinientrennung liegt ab \(R_s = 1{,}5\) vor.
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