Retention und Elutionsreihenfolge an Normal- und Umkehrphase
Wie die Polarität von Analyt, stationärer und mobiler Phase die Elutionsreihenfolge in der HPLC bestimmt und welche Fließmittel man an Normal- und Umkehrphase einsetzt.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Elutionsreihenfolge ist die Reihenfolge, in der Analyten die Säule verlassen. Sie folgt aus dem Polaritätsverhältnis von Analyt, stationärer und mobiler Phase.
- An der Normalphase steigt die Retention mit der Polarität: m-Kresol < Phenol < Brenzcatechin < Phloroglucin (Hexan/2-Propanol).
- An der Umkehrphase eluieren polare Stoffe zuerst: Phloroglucin < Brenzcatechin < Phenol < m-Kresol, Natriumbenzoat < Paracetamol < Coffein, Methyl- bis Butylparaben, verzweigte Isomere vor unverzweigten.
- Homologe Benzylamine trennen sich nach dem hydrophoben Rest, nicht nach dem \(\mathrm{p}K_\mathrm{a}\). Saurer Eluent protoniert sie und schwächt die Retention.
- RP-Eluenten sind Wasser oder Puffer mit Acetonitril, Methanol oder Propan-2-ol. Wasser/n-Hexan ist nicht mischbar und ungeeignet.
- Die Selektivität \(\alpha = k_2/k_1\) ändert sich mit Eluent oder Phase (Acetonitril zu THF, RP-18 zu Cyanopropyl), nicht mit dem Detektor.
Dieses Kapitel ist für Supporter
Relaxed ins Stex ist ein kleines, unabhängiges Projekt. Mit einem Zugang unterstützt du uns und schaltest das ganze 1. Staatsexamen frei. ❤️
Bitte bestätige zuerst deine E-Mail-Adresse
Wir haben dir einen Link geschickt. Erst mit bestätigter E-Mail-Adresse kannst du einen Zugang freischalten und nutzen.
Worum es geht
In der HPLC hängt die Elutionsreihenfolge vor allem davon ab, wie polar ein Analyt im Vergleich zu den beiden Phasen ist. Wer das versteht, kann aus einer Strukturformel vorhersagen, ob Paracetamol vor Coffein oder ein Paraben vor dem nächsten erscheint. Das braucht man täglich in der Arzneimittelprüfung, wenn Peaks zugeordnet oder Methoden gewählt werden.
Polarität als Trennprinzip
Zwei Phasen konkurrieren um jeden Analyten: die stationäre Phase in der Säule und die mobile Phase, die ihn weitertransportiert. Entscheidend ist ihr Polaritätsverhältnis. Bei der Normalphase (NP) ist die stationäre Phase polarer als der Eluent. Typisch ist Kieselgel mit Silanolgruppen und ein unpolares Fließmittel wie n-Hexan.
Bei der Umkehrphase (RP) ist es umgekehrt. Unpolare Alkylketten wie C18 bilden die stationäre Phase, der Eluent ist wässrig und polar. Wie Adsorption und Verteilung im Einzelnen wirken, erklären die chromatographischen Trennprinzipien.
Je stärker ein Analyt mit der stationären Phase wechselwirkt, desto länger bleibt er auf der Säule. Daraus ergibt sich seine Position im Chromatogramm. Die Abbildung stellt beide Systeme nebeneinander.
Die Elutionsreihenfolge ist die Reihenfolge, in der die Komponenten einer Probe die Säule verlassen und als Peaks erscheinen. Sie folgt aus der relativen Stärke, mit der jeder Analyt an der stationären Phase festgehalten wird.
Gleiches hält Gleiches: Ein Analyt bleibt an der Phase, der er in der Polarität ähnelt. Wer der mobilen Phase ähnelt, kommt zuerst.
Normalphasenchromatographie
An der Normalphase binden polare Gruppen über Wasserstoffbrücken an die Silanolgruppen des Kieselgels. Die Retentionszeit steigt deshalb mit der Polarität des Analyten. Die lipophilsten Stoffe haben am wenigsten Halt und eluieren zuerst.
Gut zeigen lässt sich das an vier Phenolen mit Hexan/2-Propanol als Eluent. Für die Abschätzung zählt man die OH-Gruppen. Eine Methylgruppe senkt die Polarität zusätzlich etwas. So ergibt sich die Reihe m-Kresol < Phenol < Brenzcatechin < Phloroglucin:
- m-Kresol: eine OH-Gruppe plus unpolare Methylgruppe, eluiert zuerst
- Phenol: eine OH-Gruppe
- Brenzcatechin (1,2-Dihydroxybenzol): zwei OH-Gruppen
- Phloroglucin (1,3,5-Trihydroxybenzol): drei OH-Gruppen, wird am längsten festgehalten
Dieselbe Logik gilt in der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel. Dort ist sie unter Retention und Polarität in der DC beschrieben.
Umkehrphasenchromatographie
An der Umkehrphase halten hydrophobe Wechselwirkungen den Analyten an den Alkylketten fest. Man kann sich die C18-Schicht wie einen dünnen Ölfilm vorstellen, in den sich lipophile Moleküle zurückziehen. Polarere Stoffe eluieren deshalb vor unpolareren, die lipophilere Substanz wird stärker retardiert.
Für die Phenole kehrt sich die Reihenfolge der Normalphase damit genau um. An RP-18 mit Acetonitril/Wasser gilt Phloroglucin < Brenzcatechin < Phenol < m-Kresol. Jede zusätzliche OH-Gruppe verkürzt die Retention, die Methylgruppe verlängert sie.
Die Elutionsreihenfolge an RP aus Strukturformeln abzuleiten, wird im Examen gerne gefragt. Achte darauf, dass sich die Phenolreihe gegenüber der Normalphase exakt umkehrt und dass bei gleicher Kohlenstoffzahl das verzweigte Isomer vor dem unverzweigten eluiert.
Reihenfolge aus der Struktur ableiten
Mit wenigen Fragen lässt sich fast jede Aufgabe lösen:
- Ladung prüfen: Ionisierte Gruppen wie Carboxylat oder Ammonium machen einen Stoff sehr polar. Er eluiert früh.
- Polare Gruppen zählen: OH, freies \(\ce{NH2}\) und COOH binden Wasser über Wasserstoffbrücken und verkürzen die Retention.
- Unpolare Anteile bewerten: Methylgruppen, längere Alkylketten und Halogene wie Chlor verlängern die Retention.
- Verzweigung beachten: Bei gleicher Kohlenstoffzahl eluiert das verzweigte Isomer früher. Es ist kompakter und berührt die Alkylketten auf kleinerer Fläche.
Arzneistoffbeispiele
An C-18 mit Methanol/Wasser erscheint zuerst Natriumbenzoat, dann Paracetamol, zuletzt Coffein. Benzoat liegt als Anion vor und ist damit am polarsten. Analog eluiert Acetylsalicylsäure vor Paracetamol und Coffein. Coffein trägt keine OH- oder NH-Gruppe, aber drei N-Methylgruppen, und wird am längsten retardiert.
Acetylsalicylsäure eluiert nur früh, solange ihre Carbonsäuregruppe dissoziiert ist. In stark saurem Eluent liegt sie ungeladen vor, wird stärker retardiert und kann dann nach Paracetamol erscheinen.
Bei Anilinderivaten an RP-8 sinkt die Polarität Schritt für Schritt, wie die Abbildung zeigt:
| Analyt | Änderung gegenüber dem Vorgänger | Folge |
|---|---|---|
| 4-Aminophenol | freie \(\ce{NH2}\)- und OH-Gruppe | eluiert zuerst |
| Paracetamol (4-Hydroxyacetanilid) | Aminogruppe acetyliert | später |
| Acetanilid | OH-Gruppe fehlt | noch später |
| 4-Chloracetanilid | Cl statt H in 4-Position | eluiert zuletzt |
In einer homologen Reihe entscheidet die Kettenlänge. Parabene eluieren an C18 mit Wasser/Methanol als Methyl- < Ethyl- < Propyl- < Isobutyl- < Butylparaben. Jede \(\ce{CH2}\)-Gruppe verlängert die Retention. Isobutyl- und Butylparaben haben gleich viele C-Atome, das verzweigte Isobutylparaben kommt zuerst.
Grenzen der Methode
RP ist keineswegs nur etwas für lipophile Stoffe. Mit hohem Wasseranteil trennt man auch viele hydrophile Arzneistoffe. Anorganische Salze wie \(\ce{Na2SO4}\) und \(\ce{K2SO4}\) trennt RP mit Methanol/Wasser aber nicht. Ihre Ionen werden nicht retardiert und erscheinen zusammen mit der Totzeit. Dafür gibt es die Ionenchromatographie.
Basische Amine an RP-Phasen
4-Methylbenzylamin und 4-Propylbenzylamin tragen dieselbe Aminomethylgruppe. Ihre \(\mathrm{p}K_\mathrm{a}\)-Werte sind deshalb fast gleich und erklären die Trennung nicht. Entscheidend ist die Größe des hydrophoben Molekülteils. Die Propylkette geht stärkere hydrophobe Wechselwirkungen mit RP-18 ein. 4-Propylbenzylamin wird daher stärker zurückgehalten und eluiert später.
Der pH des Eluenten verschiebt das Bild. In saurem Eluent nimmt die Aminogruppe ein Proton auf:
\[\ce{R-CH2-NH2 + H3O+ <=> R-CH2-NH3+ + H2O}\]
Das Ammonium-Ion ist geladen und deutlich hydrophiler. Basische Amine werden mit saurem Eluenten deshalb schwächer retiniert als mit neutralem. Beide Homologe rücken dann nah an die Totzeit. Ein stark saures Elutionsmittel ist für ihre Trennung daher nicht optimal. Wie man geladene Basen dennoch retardiert, zeigt die Ionenpaarchromatographie.
Mobile Phasen und Selektivität
An der Umkehrphase dienen polare Lösungsmittelgemische als Eluent. Gängig ist Wasser mit Acetonitril, Methanol oder Propan-2-ol. Wässrige Puffer können das Wasser ersetzen und halten den pH konstant. Das ist bei Säuren und Basen wichtig, wie die Beispiele oben zeigen. Ein Zusatz wie 1 % Trifluoressigsäure ist möglich, aber keine Pflicht. Je mehr organisches Lösungsmittel, desto stärker eluiert das Gemisch, wie die eluotrope Reihe beschreibt.
An der Normalphase nimmt man ein unpolares Lösungsmittel wie n-Hexan und mischt einen polaren Modifier wie Methanol oder 2-Propanol zu. Welche Lösungsmittelpaare taugen, wird im Examen gerne gefragt. Die Antwort hängt an der Mischbarkeit: Wasser und n-Hexan bilden zwei Phasen und sind als mobile Phase ungeeignet. Beide Phasentypen lassen sich übrigens mit der Massenspektrometrie koppeln.
Die Selektivität \(\alpha\) beschreibt, wie gut ein System zwei Analyten unterscheidet: \(\alpha = k_2/k_1\). Dabei ist \(k\) der Retentionsfaktor des später (\(k_2\)) und des früher (\(k_1\)) eluierenden Stoffs, dimensionslos.
Die Selektivität hängt davon ab, welche Wechselwirkungen ein System anbietet. Ersetzt man im Eluenten Acetonitril durch Tetrahydrofuran, wechseln Dipol- und Wasserstoffbrückenbeiträge. Ähnliches gilt beim Wechsel von RP-18 auf eine Cyanopropyl-Phase, die zusätzlich polare Nitrilgruppen trägt. In beiden Fällen kann sich die Elutionsreihenfolge ändern. Ein anderer Detektor ändert sie dagegen nicht. Er sitzt hinter der Säule und registriert nur, was dort ankommt.
Quiz
Aussage 1
Isobutylparaben verlässt eine C18-Säule mit Wasser/Methanol früher als Butylparaben.
Bei gleicher Kohlenstoffzahl eluiert das verzweigte Isomer früher, weil es eine kleinere Kontaktfläche zu den Alkylketten bietet.
Aussage 2
An RP-8 wird Acetanilid schwächer retardiert als Paracetamol.
Acetanilid fehlt die OH-Gruppe des Paracetamols. Es ist weniger polar und eluiert nach Paracetamol.
Aussage 3
In der Normalphasenchromatographie werden die lipophilsten Analyte am längsten auf der Säule festgehalten.
Die polare stationäre Phase hält polare Analyte fest. Die lipophilsten Stoffe eluieren an der Normalphase zuerst.
Aussage 4
4-Propylbenzylamin wird an RP-18 stärker zurückgehalten als 4-Methylbenzylamin, weil sein hydrophober Molekülteil größer ist.
Die Basizität beider Amine ist fast gleich. Die längere Propylkette sorgt für stärkere hydrophobe Wechselwirkungen.
Aussage 5
An einer Normalphase mit Hexan/2-Propanol eluiert m-Kresol vor Phloroglucin.
An der Normalphase steigt die Retention mit der Polarität. m-Kresol hat eine OH- und eine Methylgruppe, Phloroglucin drei OH-Gruppen.
Aussage 6
Ein Gemisch aus Wasser und n-Hexan ist eine geeignete mobile Phase für die HPLC.
Wasser und n-Hexan sind nicht mischbar und bilden zwei Phasen. Für RP nimmt man Wasser mit Acetonitril, Methanol oder Propan-2-ol, für NP n-Hexan mit Methanol.
Aussage 7
Ersetzt man in der RP-HPLC Acetonitril durch Tetrahydrofuran, kann sich die Elutionsreihenfolge ändern.
Der Lösungsmittelwechsel verändert die Wechselwirkungen und damit die Selektivität. Ein Detektorwechsel hätte diese Wirkung nicht.
Aussage 8
An RP-18 mit Acetonitril/Wasser erscheint Brenzcatechin erst nach Phenol.
Brenzcatechin ist mit zwei OH-Gruppen polarer als Phenol und eluiert an der Umkehrphase früher.
Fehler entdeckt oder eine Idee? Wir verbessern die Inhalte laufend. Melde es uns gerne über dieses Formular ❤️
Teile der Inhalte wurden mithilfe von KI-Systemen erstellt und werden fortlaufend redaktionell geprüft. Trotz Sorgfalt können Fehler enthalten sein. Wichtige Informationen bitte anhand offizieller Quellen prüfen. Relaxed ins Stex ist ein unabhängiges Angebot und steht in keiner Kooperation mit dem IMPP. Das Angebot ist weder vom IMPP autorisiert noch mit diesem verbunden.