Isokratische und Gradientenelution, Temperatur und Entgasung
Wie isokratische Elution und Gradientenelution sich unterscheiden, was die Säulentemperatur an Retention, Peakform und Rotamerenpeaks verändert und warum Eluenten entgast werden.
Das Wichtigste in Kürze
- Bei der isokratischen Elution bleibt die Zusammensetzung der mobilen Phase konstant, bei der Gradientenelution steigt die Elutionskraft während des Laufs.
- Eine isokratische mobile Phase kann ein Lösungsmittelgemisch sein, eine Pumpe genügt, und die Basislinie driftet nicht.
- Im RP-Gradienten steigt der Anteil der organischen Komponente, was die Retentionszeiten verkürzt; Fluss- oder Temperaturänderungen sind kein Gradient.
- Höhere Säulentemperatur senkt die Viskosität, verkürzt Retentionszeiten, verringert Halbwertsbreiten und erhöht Peakhöhen.
- Ramipril bildet durch gehinderte Amidrotation cis/trans-Rotamere mit gleicher Konstitution und Konfiguration; erhöhte Temperatur beschleunigt ihre Umwandlung und vereint die Peaks.
- Entgast wird durch Ultraschall unter Vakuum oder Heliumspülung; Blasen stören die Pumpenförderung und entstehen durch Druckentlastung in der Detektorzelle.
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Worum es geht
In der HPLC steuert man eine Trennung nicht nur über Säule und Eluent, sondern auch darüber, ob sich die Zusammensetzung der mobilen Phase während des Laufs ändert. Dazu kommen zwei Betriebsgrößen: die Säulentemperatur und gelöste Gase im Eluenten. Beides entscheidet in der Arzneimittelprüfung mit, ob ein Peak schmal und reproduzierbar erscheint, etwa beim ACE-Hemmer Ramipril.
Isokratische Elution
Bei der isokratischen Elution bleibt die Zusammensetzung der mobilen Phase während des ganzen Laufs gleich. Das griechische isos (gleich) bezieht sich also auf das Fließmittel. Die mobile Phase darf dabei durchaus ein Gemisch sein, etwa Methanol und Phosphatpuffer im Verhältnis 60:40. Entscheidend ist nur, dass dieses Verhältnis vom Injizieren bis zum letzten Peak konstant bleibt.
Daraus folgt auch der apparative Aufwand. Eine einzige Pumpe genügt, denn das Gemisch kann fertig vorgemischt aus einem Vorratsgefäß kommen. Mehrere Pumpen braucht man erst, wenn das Verhältnis gezielt verändert werden soll. Weil sich der Eluent nicht ändert, bleibt auch sein Detektorsignal gleich. Die Basislinie verläuft stabil und driftet nicht stetig nach oben oder unten.
Die Definition der isokratischen Elution wird im Examen gerne gefragt: Konstant ist allein die Zusammensetzung der mobilen Phase. Druck, Säulentemperatur oder eine einheitliche Partikelgröße der stationären Phase beschreibt der Begriff nicht.
Gradientenelution
Bei der Gradientenelution steigt die Elutionskraft der mobilen Phase während des Laufs kontinuierlich an. Man mischt dazu dem Startfließmittel nach Programm immer mehr eines stärker eluierenden Lösungsmittels zu. In der Umkehrphasenchromatographie ist das die lipophile, organische Komponente, etwa Acetonitril oder Methanol. Ihr steigender Anteil verkürzt die Retentionszeiten, weil lipophile Analyte nun leichter von der unpolaren stationären Phase gelöst werden.
Der Nutzen zeigt sich bei Proben mit sehr unterschiedlich stark retinierten Stoffen. Isokratisch drängen sich die frühen Peaks, während die späten breit und flach werden. Mit Gradient erscheinen alle Peaks ähnlich schmal, wie die Abbildung zeigt.
Der Gradient betrifft immer die Zusammensetzung des Eluenten. Wer nur die Fließgeschwindigkeit erhöht oder die Temperatur von Säule oder Eluent während des Laufs ändert, fährt keine Gradientenelution. Umkehrphasenchromatographie ist außerdem ein Trennprinzip und keine Gradiententechnik. Sie lässt sich isokratisch wie mit Gradient betreiben.
Säulentemperatur
Die Temperatur der Trennsäule wird meist mit einem Säulenofen konstant gehalten. Erhöht man sie, sinkt zuerst die Viskosität der mobilen Phase. Der Säulendruck fällt, und die Analyte diffundieren schneller zwischen mobiler und stationärer Phase. Der Stoffaustausch wird dadurch effizienter.
Daraus folgen die typischen Effekte auf das Chromatogramm:
- Retentionszeiten werden kürzer, weil sich das Verteilungsgleichgewicht zur mobilen Phase verschiebt.
- Halbwertsbreiten werden kleiner, die Peaks also schärfer.
- Peakhöhen nehmen zu, denn dieselbe Peakfläche verteilt sich auf eine geringere Breite.
Die Halbwertsbreite ist dabei die Peakbreite in halber Höhe.
Einen Sonderfall bilden Moleküle, die als langsam ineinander übergehende Rotamere vorliegen. Bei Raumtemperatur trennt die Säule beide Formen teilweise auf. Es entsteht ein gespaltener Peak mit einem Plateau dazwischen, weil sich Moleküle noch während der Wanderung umwandeln. Bei erhöhter Temperatur läuft diese Umwandlung so schnell, dass die Säule nur noch einen gemittelten Zustand sieht. Die Trennung der Rotamere wird verhindert, und ein einziger, schmaler Peak bleibt.
Rotamere
Die C–N-Bindung eines Amids ist durch Mesomerie mit der Carbonylgruppe teilweise eine Doppelbindung. Die freie Drehung um sie ist deshalb gehindert. Bei tertiären Amiden, wie sie am Ringstickstoff prolinartiger Bausteine entstehen, sind beide Stellungen ähnlich stabil und liegen nebeneinander vor.
Rotamere sind Konformere, die durch Drehung um eine Einfachbindung mit hoher Rotationsbarriere ineinander übergehen. Sie haben gleiche Konstitution und gleiche Konfiguration.
Ramipril ist das Standardbeispiel. Seine Amidbindung verknüpft den Alaninbaustein mit dem bicyclischen Ringsystem. Es liegt deshalb als cis- und trans-Amid-Rotamer vor. Beide unterscheiden sich nur darin, wie die Carbonylgruppe zum Bicyclus steht.
So erkennst du Rotamere an zwei Strukturformeln: Prüfe zuerst, ob dieselben Atome gleich verknüpft sind. Vergleiche dann jedes Stereozentrum, bei Ramipril sind alle fünf S-konfiguriert. Stimmt beides überein und ist nur der Molekülteil um die Amidachse gedreht gezeichnet, handelt es sich um Rotamere. Unterscheidet sich dagegen ein Stereozentrum, liegen Diastereomere vor.
Entgasung der Eluenten
Eluenten enthalten gelöste Luft. Sie muss vor der Trennung entfernt werden, die Entgasung erfolgt deshalb im Vorratsgefäß, also vor der Pumpe. Bewährt sind zwei Verfahren. Man behandelt den Eluenten mit Ultraschall unter vermindertem Druck. Oder man spült ihn kontinuierlich mit Helium, das selbst schwer löslich ist und die übrigen Gase austreibt. Eine Inertgasspülung zwischen Injektionsventil und Vorsäule wäre dagegen der falsche Ort, denn dort ist der Eluent längst in der Anlage.
Gasblasen stören an zwei Stellen. Saugt die Pumpe eine Blase an, fördert sie nicht mehr das programmierte Volumen, und Fluss oder Mischungsverhältnis weichen ab. Nach der Säule fällt der Druck stark ab. Gelöstes Gas kann dann in der Detektorzelle durch diese Druckentlastung ausperlen und Störsignale erzeugen. Das Schema zeigt den Druckverlauf entlang des Fließwegs und die kritischen Stellen.
Gas löst sich unter Druck und perlt beim Entspannen aus. Deshalb entstehen Blasen dort, wo der Druck niedrig ist: beim Ansaugen in der Pumpe und hinter der Säule im Detektor.
Welche Detektoren besonders empfindlich reagieren, behandelt die Einheit zu den HPLC-Detektoren.
Quiz
Aussage 1
Eine isokratische Trennung kann mit einem Gemisch aus Acetonitril und Puffer im festen Verhältnis 50:50 durchgeführt werden.
Isokratisch heißt nur, dass die Zusammensetzung konstant bleibt. Ein Gemisch ist erlaubt, solange sich das Verhältnis nicht ändert.
Aussage 2
Die beiden Rotamere von Ramipril unterscheiden sich in der Konfiguration eines Stereozentrums.
Rotamere haben gleiche Konstitution und Konfiguration. Bei Ramipril unterscheiden sie sich nur durch die Drehung um die Amidbindung; alle fünf Stereozentren sind S-konfiguriert.
Aussage 3
Der Begriff isokratisch besagt, dass der Säulendruck während der Trennung konstant gehalten wird.
Isokratisch bezieht sich auf die konstante Zusammensetzung der mobilen Phase, nicht auf Druck oder Temperatur.
Aussage 4
Gasblasen in der Detektorzelle können entstehen, weil der Druck hinter der Säule stark abfällt.
Durch die Druckentlastung perlt gelöstes Gas aus und verursacht Störsignale.
Aussage 5
Bei einer Gradientenelution an einer Umkehrphase nimmt der Acetonitrilanteil im Laufe der Trennung ab.
In der RP steigt der Anteil der organischen, lipophilen Komponente. Dadurch nimmt die Elutionskraft zu und die Retentionszeiten werden kürzer.
Aussage 6
Wird die Säulentemperatur erhöht, werden die Peaks schmaler und höher.
Die geringere Viskosität verbessert den Stoffaustausch. Die Halbwertsbreiten sinken, und dieselbe Fläche ergibt einen höheren Peak.
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