Direkte Enantiomerentrennung an chiralen Phasen
Wie chirale stationäre Phasen auf Basis von Cellulosederivaten, Cyclodextrinen, Proteinen und Peptiden Enantiomere in der HPLC ohne vorherige Derivatisierung trennen.
Das Wichtigste in Kürze
- Bei der direkten Enantiomerentrennung trennt die HPLC Enantiomere kleiner organischer Moleküle unverändert an einer chiralen stationären Phase.
- Der chirale Selektor bildet mit beiden Enantiomeren unterschiedlich stabile diastereomere Komplexe, das stärker gebundene eluiert später.
- Das Dreipunktmodell: Nur ein Enantiomer erreicht alle drei Kontaktpunkte des Selektors gleichzeitig.
- Cellulose-tris(4-methylbenzoat) und β-Cyclodextrin sind chirale Phasen, an denen sich die Enantiomere von Ibuprofen trennen lassen.
- Protein- und Peptidselektoren sind meist kovalent gebunden, arbeiten mit wasserhaltigen Elutionsmitteln und trennen über reversible Bindung im nativen Zustand.
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Worum es geht
Viele Arzneistoffe wie Ibuprofen enthalten ein Stereozentrum. Ihre Enantiomere wirken oft unterschiedlich, daher muss die Arzneimittelprüfung sie getrennt erfassen können. Am einfachsten gelingt das in der HPLC an einer chiralen stationären Phase.
Prinzip der direkten Trennung
Enantiomere haben in achiraler Umgebung identische Eigenschaften. An einer gewöhnlichen Umkehrphase eluieren sie deshalb gemeinsam (Enantiomere und Diastereomere in der HPLC). Die HPLC trennt Enantiomere kleiner organischer Moleküle trotzdem, wenn die stationäre Phase selbst chiral ist. Das nennt man direkte Enantiomerentrennung, denn der Analyt bleibt unverändert. Den Gegenweg über Derivate behandelt die indirekte Enantiomerentrennung, den Überblick gibt direkte und indirekte Trennung.
Ein chiraler Selektor ist ein enantiomerenreiner Baustein der stationären Phase. Er wechselwirkt mit den beiden Enantiomeren eines Analyten unterschiedlich stark.
Selektor und Analyt bilden kurzlebige Assoziate. Mit dem (R)- und dem (S)-Enantiomer entstehen dabei zwei diastereomere Komplexe. Diastereomere unterscheiden sich in ihrer Stabilität. Das stärker gebundene Enantiomer bleibt länger auf der Säule und eluiert später.
Warum das so ist, erklärt das Dreipunktmodell. Ein Enantiomer bildet drei Kontakte zum Selektor gleichzeitig aus, etwa eine Wasserstoffbrücke, eine π-π-Wechselwirkung und eine sterische Passung. Sein Spiegelbild erreicht nur zwei davon. Man kann sich das wie eine rechte Hand vorstellen, die nur in den rechten Handschuh ganz hineinpasst.
Im Chromatogramm eines Racemats zeigt sich der Effekt unmittelbar. An achiraler Phase erscheint ein Peak, an chiraler Phase erscheinen zwei Peaks gleicher Fläche. Aus den Flächen berechnet man bei unreinen Proben den Enantiomerenüberschuss.
Dass sich Enantiomere kleiner organischer Moleküle per HPLC trennen lassen, wird im Examen gerne gefragt. Entscheidend ist die Bedingung: Die Trennung gelingt direkt an einer chiralen stationären Phase, an einer achiralen Phase dagegen nicht.
Polysaccharid- und Cyclodextrinphasen
Für kleine Arzneistoffe sind Kohlenhydrate die wichtigsten Selektoren. Cellulose-tris(4-methylbenzoat) ist Cellulose, deren drei OH-Gruppen je Glucoseeinheit mit 4-Methylbenzoesäure verestert sind. Die Ester sitzen an C-2, C-3 und C-6. Das Polymer bildet eine Helix mit chiralen Furchen, meist auf Kieselgel aufgezogen. Analyten lagern sich dort ein und binden über Wasserstoffbrücken zu den Estergruppen und π-π-Wechselwirkungen mit den Aromaten.
β-Cyclodextrin ist ein ringförmiges Oligosaccharid aus sieben α-1,4-verknüpften Glucoseeinheiten. Es hat die Form eines Kegelstumpfs mit lipophiler Kavität und hydrophilen Rändern. Am engen Rand sitzen die primären, am weiten die sekundären OH-Gruppen. Lipophile Molekülteile bilden in der Kavität Einschlusskomplexe. Die chirale Erkennung geschieht am Rand, wo die OH-Gruppen das Stereozentrum unterschiedlich gut binden.
Ibuprofen zeigt, wie das zusammenspielt. Der Isobutylphenylrest taucht in den Hohlraum ein. Das Stereozentrum mit der Carbonsäuregruppe liegt am weiten Rand. Die Ibuprofen-Enantiomere lassen sich an beiden Phasen trennen, also an Cellulose-tris(4-methylbenzoat) und an β-Cyclodextrin.
Protein- und Peptidphasen
Auch Proteine und Peptide dienen als chirale Selektoren. Beispiele sind α1-saures Glykoprotein, Rinderserumalbumin und makrocyclische Glykopeptide wie Vancomycin oder Teicoplanin. Sie sind meist kovalent an Kieselgel gebunden. So bleiben sie fest auf der Säule und werden vom Eluenten nicht ausgewaschen.
Die Trennung beruht auf reversibler, enantioselektiver Bindung, ähnlich der Plasmaproteinbindung. Dafür muss der Selektor in seiner nativen Faltung bleiben. Eine Denaturierung würde die chirale Bindungstasche zerstören, statt die Trennung zu bewirken. Deshalb arbeitet man mit wasserhaltigen Elutionsmitteln, also Pufferlösungen mit wenig organischem Modifier wie 2-Propanol oder Acetonitril.
Vancomycin ist hier selbst der Selektor, fest an die Phase gebunden. Ein Antibiotikum als Konservierungszusatz braucht die mobile Phase nicht.
Quiz
Aussage 1
Ibuprofen-Enantiomere lassen sich an β-Cyclodextrin nicht trennen, weil der Isobutylphenylrest zu groß für die Kavität ist.
Der Isobutylphenylrest lagert sich in die Kavität ein, das Stereozentrum liegt am Rand. Ibuprofen ist an β-Cyclodextrin wie an Cellulose-tris(4-methylbenzoat) trennbar.
Aussage 2
Ein Racemat eines kleinen Arzneistoffs ergibt an einer chiralen stationären Phase in der HPLC zwei Peaks gleicher Fläche.
Die beiden Enantiomere bilden unterschiedlich stabile diastereomere Komplexe mit dem Selektor und eluieren getrennt, im Racemat zu gleichen Anteilen.
Aussage 3
Bei protein- oder peptidmodifizierten chiralen Phasen verwendet man wasserhaltige Elutionsmittel.
Gepufferte wässrige Eluenten mit wenig organischem Modifier erhalten die native Faltung des Selektors.
Aussage 4
An Proteinphasen entsteht die Enantioselektivität dadurch, dass ein Enantiomer das Protein reversibel denaturiert.
Die Trennung beruht auf reversibler Bindung an das native Protein. Eine Denaturierung würde die chirale Bindungstasche zerstören.
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