Detektion und quantitative Auswertung
Wie man farblose Substanzzonen auf der DC-Platte sichtbar macht und wie der DC-Scanner sie direkt auf der Schicht quantifiziert.
Das Wichtigste in Kürze
- Die Detektion macht farblose Zonen auf der DC-Platte sichtbar: über Eigenfarbe, UV-Licht oder Sprühreagenzien.
- Bei der Fluoreszenzminderung absorbiert der Analyt das Licht bei 254 nm, der Indikator der \(\mathrm{F_{254}}\)-Schicht bleibt dunkel; aromatische Stoffe wie Benzoesäure oder Gallussäure geben dunkle Zonen, Essigsäure nicht.
- Permanganat oxidiert Chlorid in salzsaurer Lösung zu Chlorgas; überschüssiges Chlor oxidiert Iodid zu Iod, das mit Stärke die blaue Iod-Amylose-Verbindung bildet.
- Der DC-Scanner misst die Remission direkt auf der Platte und registriert Remissions-Orts-Kurven, in denen jede Zone ein Peak ist.
- Die Peakfläche wird über Referenzen auf derselben Platte in eine Menge umgerechnet; die Kalibrierkurve ist meist leicht gekrümmt.
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Worum es geht
Die meisten Arzneistoffe sind farblos und nach der Entwicklung auf der Platte unsichtbar. Detektionsverfahren machen ihre Zonen sichtbar, und der DC-Scanner macht daraus Messwerte für Gehalt und Reinheit.
Detektionsmöglichkeiten
Nach der Entwicklung muss man die Zonen erst finden. Farbige Stoffe erkennt man direkt an ihrer Eigenfarbe. Für farblose Stoffe gibt es drei Wege:
- UV-Licht bei 254 nm auf Platten mit Fluoreszenzindikator
- UV-Licht bei 365 nm für Stoffe mit Eigenfluoreszenz
- Sprüh- oder Tauchreagenzien, die mit dem Analyten ein farbiges Produkt bilden
Der Fluoreszenzindikator ist ein Leuchtstoff, den der Hersteller der Schicht beimischt. Die Kennzeichnung \(\mathrm{F_{254}}\) zeigt ihn an. Bei \(\mathrm{GF_{254}}\) steht das G zusätzlich für Gips als Bindemittel.
Fluoreszenzminderung
Unter der UV-Lampe leuchtet eine \(\mathrm{F_{254}}\)-Platte gleichmäßig grün. Liegt eine Substanz auf der Schicht, erscheint dort ein dunkler Fleck.
Eine Substanzzone absorbiert das Anregungslicht bei 254 nm, bevor es den Indikator erreicht. Der Indikator darunter wird nicht angeregt und bleibt dunkel.
Die Zone wirft also gewissermaßen einen Schatten auf den Leuchtstoff. Die Substanz selbst muss dafür nicht fluoreszieren.
Bei 254 nm absorbieren vor allem aromatische und konjugierte Systeme. Deshalb geben Acetophenon, Benzaldehyd, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure und Diflunisal deutliche dunkle Zonen. Auch Propylgallat und Gallussäure lassen sich so nachweisen, wichtig für die Gallat-Prüfungen. Essigsäure dagegen hat keinen Aromaten und mindert die Fluoreszenz praktisch nicht.
Anders als bei der Fluoreszenzminderung leuchtet bei der Eigenfluoreszenz die Substanz selbst, weil sie das Licht absorbiert und wieder abstrahlt (Grundlagen im Jablonski-Diagramm). Die Gallate zeigen keine intensive rote Eigenfluoreszenz bei 486 nm. Man sieht sie nur als dunkle Zonen.
Kaliumiodid-Stärke-Detektion
Diese Detektion arbeitet mit Chlor, das man in der Kammer selbst erzeugt. Kaliumpermanganat oxidiert dafür Chlorid in salzsaurer Lösung zu Chlorgas. Eine Disproportionierung zu \(\ce{MnO2}\) und Manganat(VI) findet dabei nicht statt, Mangan wird zu \(\ce{Mn^2+}\) reduziert (mehr zum Oxidationsmittel in der Permanganometrie):
\[\ce{2 MnO4- + 16 H+ + 10 Cl- -> 2 Mn^2+ + 5 Cl2 ^ + 8 H2O}\]
Der Ablauf:
- Chlorieren: Die Platte steht im Chlorgas, die Analyten werden chloriert.
- Ablüften: Überschüssiges Chlor muss vollständig von der Platte verschwinden.
- Tüpfelprobe: Ein Tropfen Kaliumiodid-Stärke-Lösung am Plattenrand färbt sich blau, solange noch freies Chlor vorhanden ist.
- Besprühen: Erst danach wird die ganze Platte mit Kaliumiodid-Stärke besprüht.
Chemisch steckt dahinter die Oxidation von Iodid zu Iod, wie in der Iodometrie:
\[\ce{Cl2 + 2 I- -> 2 Cl- + I2}\]
Das Iod bildet mit Stärke die blaue Iod-Amylose-Einschlussverbindung.
DC-Scanner
Ein DC-Scanner wertet das Chromatogramm direkt auf der Platte quantitativ aus. Man muss die Zonen also nicht abkratzen und eluieren. Er misst spektralphotometrisch die Remission, also das diffus von der Schicht zurückgestreute Licht.
Eine Lampe liefert Licht, ein Monochromator wählt die Wellenlänge. Ein schmaler Lichtspalt fällt auf die Bahn, während ein Tisch die Platte darunter verschiebt. Ein Detektor erfasst das remittierte Licht. Wo eine Zone absorbiert, sinkt die Remission.
Auftragung des Messsignals gegen den Ort entlang der Laufstrecke. Jede Substanzzone erscheint darin als Peak.
Die Peakfläche hängt von der Substanzmenge in der Zone ab. Zur Quantifizierung trägt man Referenzlösungen bekannter Menge auf dieselbe Platte auf. Daraus entsteht eine Kalibrierkurve. Sie ist wegen der Lichtstreuung in der Schicht meist leicht gekrümmt.
Quiz
Aussage 1
Ein DC-Scanner registriert Remissions-Orts-Kurven, in denen jede Substanzzone als Peak erscheint.
Der Scanner misst das remittierte Licht entlang der Bahn. Jede absorbierende Zone erzeugt einen Peak, dessen Fläche die Menge liefert.
Aussage 2
Für die Fluoreszenzminderung muss die Substanz selbst nicht fluoreszieren, sie muss nur das Anregungslicht bei 254 nm absorbieren.
Die Zone schirmt den Fluoreszenzindikator der Schicht ab. Leuchten muss nur der Indikator, nicht der Analyt.
Aussage 3
Essigsäure ist auf Kieselgel \(\mathrm{GF_{254}}\) unter UV-Licht von 254 nm als deutliche dunkle Zone zu erkennen.
Essigsäure hat kein aromatisches System und absorbiert bei 254 nm kaum. Sie mindert die Fluoreszenz praktisch nicht, anders als etwa Benzoesäure.
Aussage 4
In salzsaurer Lösung disproportioniert Permanganat zu \(\ce{MnO2}\) und Manganat(VI), wodurch Chlor frei wird.
Permanganat oxidiert Chlorid zu Chlor und wird dabei selbst zu \(\ce{Mn^2+}\) reduziert. Eine Disproportionierung findet nicht statt.
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