Nachweisgrenze, Bestimmungsgrenze und Signal-Rausch-Verhältnis
Wie sich Nachweis- und Bestimmungsgrenze unterscheiden und wie man das Signal-Rausch-Verhältnis nach Arzneibuch berechnet und durch Signalmittelung verbessert.
Das Wichtigste in Kürze
- Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze sind Kenngrößen eines Analysenverfahrens: der kleinste sicher nachweisbare bzw. der kleinste mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit quantifizierbare Gehalt.
- Die Nachweisgrenze liegt immer unterhalb der Bestimmungsgrenze; beide werden als Gehalt, nicht als Messsignal angegeben.
- Nach Arzneibuch gilt \(S/N = 2H/h\) mit der Peakhöhe H und dem Schwankungsbereich h des Rauschens.
- Das Rauschen bestimmt man an einer Blindprobe über das 20-Fache der Halbwertsbreite als Abstand zwischen maximalem und minimalem Ausschlag.
- Ein höheres S/N senkt die minimal nachweisbare Konzentration und erhöht die Präzision.
- Bei Signalmittelung steigt das S/N mit \(\sqrt{n}\): Verdopplung der Scans ergibt etwa Faktor 1,4, Verzehnfachung etwa Faktor 3.
Worum es geht
Kein Analysenverfahren erfasst beliebig kleine Gehalte. Irgendwann geht das Signal im Untergrund unter. Für die Reinheitsprüfung von Arzneistoffen muss man wissen, wo diese Grenze liegt und wie man sie mit dem Signal-Rausch-Verhältnis beschreibt.
Signal und Untergrund
Jedes Messgerät liefert auch ohne Analyt ein Signal. Dieser Blindwert stammt von Lösungsmittel, Matrix und Elektronik. Er ist nicht konstant, sondern schwankt zufällig um einen Mittelwert. Diese zufällige Schwankung der Grundlinie heißt Rauschen.
Man kann sich das wie Stimmengewirr in einem vollen Saal vorstellen. Ein lauter Ruf geht darin nicht unter, ein Flüstern schon. Solange der Analyt viel Signal liefert, stört das Rauschen kaum. Bei kleinen Gehalten, etwa bei Verunreinigungen eines Arzneistoffs, wird das Signal aber ähnlich groß wie die Schwankung selbst.
Dann wird zuerst unsicher, wie viel Substanz vorliegt. Bei noch kleineren Gehalten ist sogar unsicher, ob sie überhaupt vorliegt. Diese beiden Schwellen beschreiben Nachweis- und Bestimmungsgrenze.
Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Beide Grenzen sind Kenngrößen eines Analysenverfahrens. Sie beantworten zwei verschiedene Fragen und dürfen nicht gleichgesetzt werden.
Auch Detektionsgrenze genannt. Der niedrigste Gehalt, bei dem eine Substanz noch zuverlässig nachgewiesen werden kann. Ihr Signal hebt sich gerade sicher vom Rauschen ab. Eine Aussage über die Menge ist hier noch nicht verlässlich.
Der niedrigste Gehalt, der mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit quantifiziert werden kann. Ab hier liefert das Verfahren einen belastbaren Zahlenwert für die Menge.
Die Nachweisgrenze ist also die minimal detektierbare Konzentration. Sie markiert gerade nicht die Grenze, bis zu der eine Gehaltsbestimmung möglich ist. Was Präzision und Richtigkeit genau bedeuten, steht auf einer eigenen Seite.
Nachweisen fragt: Ist es da? Bestimmen fragt: Wie viel ist da? Für das Wie viel braucht man mehr Signal, deshalb liegt die Nachweisgrenze immer unterhalb der Bestimmungsgrenze.
Beide Grenzen gibt man als Gehalt an, also als Substanzmenge oder Konzentration, etwa in µg/mL. Sie sind nicht als Messsignal definiert. Die Bestimmungsgrenze ist daher nicht das kleinste erfassbare Signal, sondern die Konzentration, die zu einem ausreichend großen Signal führt.
In der Praxis verknüpft man die Grenzen mit dem Signal-Rausch-Verhältnis. Üblich ist für die Nachweisgrenze ein Wert von etwa 3, für die Bestimmungsgrenze von etwa 10. Die Abbildung zeigt diese Stufen auf derselben verrauschten Grundlinie.
Signal-Rausch-Verhältnis
Das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N, signal-to-noise) setzt die Höhe eines Peaks ins Verhältnis zur Schwankung der Grundlinie. Das Arzneibuch legt für die Chromatographie eine feste Formel fest.
\[S/N = \frac{2H}{h}\]
\(H\): Peakhöhe vom Maximum bis zur extrapolierten Basislinie. \(h\): Schwankungsbereich des Untergrundrauschens. Beide in derselben Einheit, etwa mm oder mAU, sodass S/N dimensionslos ist.
Der Faktor 2 entsteht, weil \(h\) die volle Spannweite des Rauschens erfasst, also von unten bis oben. Die Bestimmung läuft in drei Schritten:
- Probe auswerten: Im Probenchromatogramm die Peakhöhe \(H\) vom Maximum zur extrapolierten Basislinie messen.
- Blindprobe auswerten: Im Chromatogramm einer Blindprobe ein Fenster vom 20-Fachen der Halbwertsbreite des Peaks wählen. Es liegt dort, wo der Peak erscheinen würde.
- Rauschen ablesen: In diesem Fenster \(h\) als Abstand zwischen maximalem und minimalem Ausschlag bestimmen und \(2H/h\) berechnen.
Wie man die Halbwertsbreite abliest, erklärt die Seite zu Chromatogramm und Retentionszeiten.
Ein Beispiel: Der Peak einer Verunreinigung ist 12 mm hoch. Das Rauschen der Blindprobe schwankt über 4 mm. Dann gilt \(S/N = 2 \cdot 12 / 4 = 6\). Die Substanz ist damit sicher nachgewiesen, denn 6 liegt über 3. Für eine verlässliche Gehaltsangabe reicht es aber nicht, denn 6 liegt unter 10.
Ein hohes S/N hat drei Folgen. Das Analytsignal hebt sich deutlicher vom Hintergrund ab. Die minimal nachweisbare Konzentration sinkt, weil schon kleinere Peaks die Schwelle erreichen. Und die Messung wird präziser, weil zufällige Schwankungen die Peakhöhe weniger verfälschen.
Signalmittelung
Bei Spektren lässt sich das S/N gezielt verbessern. Man nimmt dasselbe Spektrum mehrfach auf und mittelt die Einzelscans. Diese Signalmittelung nutzt man etwa in der FT-IR- und vor allem in der NMR-Spektroskopie.
Der Gewinn folgt aus der Natur der beiden Anteile. Das echte Signal ist in jedem Scan gleich und addiert sich linear mit der Scan-Zahl \(n\). Das Rauschen ist zufällig und hebt sich teilweise auf. Es wächst deshalb nur mit \(\sqrt{n}\). Für das Verhältnis bleibt:
\[S/N = \sqrt{n}\,\frac{S_x}{N_x}\]
Dabei ist \(S_x/N_x\) das Signal-Rausch-Verhältnis eines Einzelscans. Das S/N steigt also mit der Quadratwurzel der Scan-Zahl und nicht linear mit der Messzeit. Nach 4 Scans ist es doppelt, nach 16 Scans viermal so groß wie nach einem Scan.
Daraus ergeben sich schnelle Abschätzungen. Eine Verdopplung der Scan-Zahl bringt nur den Faktor \(\sqrt{2} \approx 1{,}4\). Eine Verzehnfachung bringt etwa den Faktor \(\sqrt{10} \approx 3\). Will man das S/N eines Spektrums von 5 auf 20 steigern, braucht man den Faktor 4. Das verlangt \(4^2 = 16\)-mal so viele Scans und damit 16-fache Messzeit.
Quiz
Aussage 1
Ein Peak mit 9 mm Höhe auf einer Grundlinie, deren Rauschen über 6 mm schwankt, hat nach Arzneibuch ein S/N von 1,5.
Nach \(S/N = 2H/h\) ergibt sich \(2 \cdot 9 / 6 = 3\). Der Faktor 2 im Zähler wurde vergessen.
Aussage 2
Die Bestimmungsgrenze eines Verfahrens wird als Substanzmenge oder Konzentration angegeben und nicht als Höhe eines Messsignals.
Beide Grenzen sind als Gehalt definiert. Die Bestimmungsgrenze ist nicht das kleinste erfassbare Messsignal.
Aussage 3
Verdoppelt man bei der Signalmittelung die Zahl der Scans, verdoppelt sich auch das Signal-Rausch-Verhältnis.
Das S/N steigt mit \(\sqrt{n}\). Eine Verdopplung der Scans bringt nur etwa den Faktor \(\sqrt{2} \approx 1{,}4\).
Aussage 4
Die Nachweisgrenze ist der niedrigste Gehalt, der mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit quantifiziert werden kann.
Das beschreibt die Bestimmungsgrenze. Die Nachweisgrenze ist der niedrigste Gehalt, bei dem eine Substanz noch zuverlässig nachgewiesen werden kann.
Aussage 5
Je höher das Signal-Rausch-Verhältnis eines Verfahrens, desto kleinere Konzentrationen des Analyten lassen sich noch nachweisen.
Bei höherem S/N erreichen schon kleinere Peaks die Nachweisschwelle, die minimal nachweisbare Konzentration sinkt.
Aussage 6
Für die Berechnung des Signal-Rausch-Verhältnisses nach Arzneibuch wird das Rauschen im Chromatogramm einer Blindprobe über einen Bereich vom 20-Fachen der Halbwertsbreite ermittelt.
In diesem Fenster misst man h als Abstand zwischen maximalem und minimalem Ausschlag und setzt es in \(S/N = 2H/h\) ein.
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