Grampositive und gramnegative Zellwand, Gram-Färbung
Wie sich die Zellwände grampositiver und gramnegativer Bakterien unterscheiden und warum die Gram-Färbung diese Unterschiede sichtbar macht.
Das Wichtigste in Kürze
- Grampositiv und gramnegativ bezeichnen zwei Zellwandtypen der Bakterien, die sich in der Gram-Färbung unterscheiden lassen.
- Grampositive Bakterien haben einen dicken, mehrschichtigen Mureinsacculus, oft mit Teichonsäuren, und keine äußere Membran.
- Gramnegative Bakterien haben eine dünne Mureinschicht im Periplasma und außerhalb davon eine asymmetrische äußere Membran: innen Phospholipide, außen LPS, dazwischen Porine für Ionen und kleine hydrophile Moleküle.
- Lipopolysaccharid besteht aus Lipid A, Kernpolysaccharid und gegebenenfalls O-Antigen und kommt nur in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien vor.
- Gram-Färbung: Kristallviolett färbt alle, Iod fixiert, Ethanol entfärbt gramnegative, Fuchsin färbt sie rot. Grampositive bleiben blauviolett.
Worum es geht
Bakterien lassen sich nach dem Bau ihrer Zellwand in zwei große Gruppen teilen: grampositiv und gramnegativ. Die Gram-Färbung macht diesen Unterschied unter dem Mikroskop sichtbar. Für die Pharmazie zählt das, weil der Wandaufbau mitbestimmt, welche Antibiotika eine Zelle erreichen.
Grampositive Zellwand
Bei grampositiven Bakterien besteht die Zellwand ganz überwiegend aus Murein. Der Mureinsacculus ist hier dick und mehrschichtig. Viele Peptidoglykan-Lagen liegen übereinander und sind miteinander quervernetzt. Dieser Sacculus ist der Hauptbestandteil der Wand und umschließt die Cytoplasmamembran wie ein fester Panzer.
Außerhalb des Mureins folgt keine weitere Lipidmembran. Grampositive Bakterien besitzen also keine äußere Membran. Das gilt auch für Corynebacterium, dessen Besonderheiten in Corynebakterien und Mykobakterien stehen.
Die beiden Wandtypen unterscheiden sich damit nicht nur in der Zusammensetzung des Peptidoglykans. Entscheidend ist das Mengenverhältnis. Ältere Lehrbücher trennen die starre Mureinschicht von der plastischen Schicht aus Membranlipiden und Lipoproteinen. Grampositive Wände bestehen aus viel Murein und kaum plastischer Schicht. Bei gramnegativen ist es umgekehrt.
In den Sacculus vieler grampositiver Bakterien sind Teichonsäuren eingelagert. Das sind Polymere aus Glycerin- oder Ribitolphosphat. Wandteichonsäuren sind kovalent an das Murein gebunden, Lipoteichonsäuren stecken mit einem Lipidanker in der Cytoplasmamembran. Teichonsäuren kommen nur bei einem Teil der Bakterien vor: Gramnegativen Zellwänden fehlen sie, und auch in der Pilzzellwand gibt es sie nicht.
Äußere Membran
Gramnegative Bakterien haben nur eine dünne Mureinschicht aus einer oder wenigen Lagen. Außerhalb davon liegt eine zweite Lipiddoppelschicht, die äußere Membran. Sie ist asymmetrisch gebaut. Ihre innere Schicht besteht aus Phospholipiden, ihre äußere aus Lipopolysaccharid (LPS). Phospholipide enthalten gramnegative Bakterien deshalb in beiden Membranen: in der Cytoplasmamembran und in der äußeren Membran.
Der periplasmatische Raum (Periplasma) liegt zwischen Cytoplasmamembran und äußerer Membran. Er enthält die dünne Mureinschicht sowie zahlreiche Enzyme und Bindeproteine.
Besonders prüfungsrelevant ist die Lage: Die äußere Membran liegt außerhalb des Mureinsacculus und begrenzt das Periplasma nach außen, sie liegt also nicht im Periplasma. Lipoproteine wie das Braun-Lipoprotein verankern sie am Murein.
In die äußere Membran sind Proteine integriert. Die wichtigsten sind die Porine. Diese Kanalproteine bilden wassergefüllte Poren, durch die kleine hydrophile Teilchen diffundieren, etwa Ionen, Zucker und Aminosäuren. Die Zellwand ist deshalb für Salze durchlässig. Große oder sehr lipophile Moleküle hält die äußere Membran dagegen zurück. Sie wirkt wie ein Zaun mit schmalen Toren. Darum erreichen manche Antibiotika das Murein gramnegativer Bakterien schlecht, mehr dazu in Wirkmechanismus der β-Lactam-Antibiotika.
Eine äußere Membran besitzen alle gramnegativen Bakterien. Beispiele sind Yersinia, Borrelia, Treponema und Chlamydia. Diese Gattungen stellt Weitere gramnegative Bakterien näher vor.
Die Abbildung stellt beide Wandtypen nebeneinander. Links liegt der dicke Sacculus mit Teichonsäuren direkt auf der Cytoplasmamembran. Rechts folgen auf die Cytoplasmamembran das Periplasma mit dünnem Murein und die äußere Membran mit Porinen und LPS.
Lipopolysaccharid
Das Lipopolysaccharid bildet die äußere Schicht der äußeren Membran. Jedes Molekül besteht aus drei Teilen, von innen nach außen:
- Lipid A: ein Glucosamin-Disaccharid mit mehreren Fettsäureketten. Es verankert das Molekül in der Membran.
- Kernpolysaccharid (Core): eine kurze, verzweigte Zuckerkette mit KDO (Ketodesoxyoctonsäure) und Heptosen.
- O-Antigen (O-Polysaccharid): eine lange Kette aus sich wiederholenden Zuckereinheiten, die nach außen ragt. Manchen Stämmen fehlt sie, daher ist sie nur gegebenenfalls vorhanden.
LPS ist ein typischer Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien. Es sitzt ausschließlich in ihrer äußeren Membran. Grampositiven Zellwänden fehlt es, weil sie keine äußere Membran haben. Auch die bakterielle Cytoplasmamembran enthält kein LPS, ebenso wenig die Pilzzellwand. Als Endotoxin wirkt vor allem Lipid A, siehe Endotoxine und Exotoxine. Die Rolle des O-Antigens als Antigen behandelt Oberflächenantigene.
Die Merkmale beider Wandtypen im Überblick:
| Merkmal | grampositiv | gramnegativ |
|---|---|---|
| Mureinschicht | dick, viele Lagen | dünn, eine bis wenige Lagen |
| Äußere Membran | fehlt | vorhanden, asymmetrisch |
| Periplasma | kein typisches Periplasma | zwischen beiden Membranen |
| Teichonsäuren | bei vielen vorhanden | fehlen |
| Lipopolysaccharid | fehlt | außen in der äußeren Membran |
| Porine | fehlen | in der äußeren Membran |
Gram-Färbung
Die Gram-Färbung ist eine Differenzialfärbung. Sie teilt Bakterien nach ihrem Zellwandaufbau in zwei Gruppen. Das Prinzip: Entscheidend ist, ob Ethanol den blauen Farbstoff-Iod-Komplex wieder aus der Zellwand herauslösen kann. Das hitzefixierte Präparat durchläuft vier Schritte.
- Kristallviolett: Der Farbstoff färbt alle Bakterien gleich violett an, auch die gramnegativen.
- Lugolsche Lösung: Iod bildet mit Kristallviolett einen großen, schwer löslichen Komplex und fixiert so den Farbstoff. Alle Zellen bleiben violett.
- Ethanol: Alkohol entfärbt gramnegative Bakterien, sie werden farblos. Grampositive behalten den Komplex.
- Gegenfärbung: Fuchsin färbt die entfärbten gramnegativen Zellen rot. Grampositive bleiben dunkelblau bis violett, weil das Violett das Rot überdeckt.
Warum verhalten sich die Zellen im dritten Schritt so verschieden? Ethanol entzieht der dicken Mureinschicht grampositiver Bakterien Wasser. Ihre Maschen ziehen sich zusammen und schließen den Komplex ein. Bei gramnegativen Bakterien löst Ethanol dagegen Lipide aus der äußeren Membran. Die dünne Mureinschicht darunter kann den Komplex nicht halten, er wird ausgewaschen.
Die Reihenfolge Kristallviolett, Iod, Ethanol, Fuchsin wird im Examen gerne gefragt. Achte darauf: Nach dem ersten Schritt sind alle Bakterien violett, Iod fixiert den Farbstoff, und grampositive Zellen erscheinen am Ende blauviolett, niemals rot.
Umgekehrt lässt sich aus der Farbe auf den Wandtyp schließen. Blauviolette Bakterien sind grampositiv, rote gramnegativ. Form und Anordnung der Zellen sieht man im selben Präparat. Wie man daraus Gattungen bestimmt, zeigt Staphylokokken und Streptokokken.
Positiv behält das Violett, negativ verliert es und wird rot.
Die Färbung hat klare Grenzen. Sie unterscheidet Wandtypen, verrät aber nichts über Geißeln. Manche Bakterien färben sich gar nicht zuverlässig, etwa die säurefesten Mykobakterien oder die zellwandlosen Mycoplasmen.
Das Gram-Ergebnis zeigt nicht, ob Murein vorhanden ist. Grampositive und gramnegative Bakterien besitzen beide Murein und unterscheiden sich nur in Dicke der Schicht und äußerer Membran.
Quiz
Aussage 1
Grampositive Bakterien besitzen statt einer äußeren Membran einen dicken, aus vielen Peptidoglykan-Lagen aufgebauten Mureinsacculus.
Der mehrschichtige Sacculus ist der Hauptbestandteil ihrer Wand. Eine äußere Membran fehlt grampositiven Bakterien.
Aussage 2
Lipopolysaccharid ist auch Bestandteil der Cytoplasmamembran grampositiver Bakterien.
LPS sitzt nur in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien. In der Cytoplasmamembran und bei grampositiven Bakterien kommt es nicht vor.
Aussage 3
Nach der Behandlung mit Kristallviolett sind grampositive und gramnegative Bakterien zunächst gleich violett gefärbt.
Der erste Schritt färbt alle Bakterien gleich an. Erst Ethanol entfärbt die gramnegativen Zellen.
Aussage 4
Bei gramnegativen Bakterien liegt die äußere Membran im periplasmatischen Raum zwischen Mureinschicht und Cytoplasmamembran.
Die äußere Membran liegt außerhalb des Mureinsacculus und begrenzt das Periplasma nach außen. Im Periplasma liegt die dünne Mureinschicht.
Aussage 5
Porine in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien lassen kleine hydrophile Teilchen wie Ionen passieren.
Porine bilden wassergefüllte Kanäle. Deshalb ist die Zellwand für Salze durchlässig.
Aussage 6
Teichonsäuren sind ein typischer Bestandteil der äußeren Membran gramnegativer Bakterien.
Teichonsäuren kommen in der Zellwand grampositiver Bakterien vor. Gramnegativen Zellwänden fehlen sie.
Aussage 7
Bakterien, die nach abgeschlossener Gram-Färbung blauviolett erscheinen, sind gramnegativ.
Blauviolett erscheinen grampositive Bakterien, weil sie den Farbstoff-Iod-Komplex behalten. Gramnegative werden durch Fuchsin rot.
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