PCR, reverse Transkription und cDNA
Wie die PCR DNA-Abschnitte vervielfältigt, welche Bestandteile ein Ansatz braucht und wie reverse Transkriptase aus mRNA cDNA macht, die Grundlage der RT-PCR.
Das Wichtigste in Kürze
- Die PCR vervielfältigt einen definierten DNA-Abschnitt in Zyklen aus Denaturierung (95 °C), Primeranlagerung (50 bis 65 °C) und Verlängerung (72 °C), idealisiert nach \(N = N_0 \cdot 2^n\).
- Die Stränge trennt die Hitze, eine Helicase ist nicht nötig. Der neue Strang wächst stets in 5’→3’-Richtung, RNA wird nicht direkt vermehrt.
- Ein PCR-Ansatz enthält DNA-Matrize, zwei einzelsträngige Primer, dATP, dCTP, dGTP, dTTP und eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase wie die Taq-Polymerase. NTPs, Ligase, Restriktionsendonuclease, RNA-Polymerase und Aminoacyl-tRNA-Synthetase gehören nicht hinein.
- cDNA entsteht aus mRNA mit reverser Transkriptase aus Retroviren, Primer und dNTPs. Sie ist intronfrei und dient zur Klonierung eukaryotischer Gene und für cDNA-Bibliotheken.
- Die RT-PCR braucht reverse Transkriptase und eine DNA-abhängige DNA-Polymerase, aber keine RNA-abhängige RNA-Polymerase. Sie dient zum Nachweis viraler RNA.
Worum es geht
Die Polymerasekettenreaktion kopiert einen ausgewählten DNA-Abschnitt in wenigen Stunden milliardenfach. Zusammen mit der reversen Transkription macht sie auch RNA nachweisbar, etwa im PCR-Test auf SARS-CoV-2. In der Pharmazie begegnet sie dir in Diagnostik, Gentechnik und der Herstellung rekombinanter Arzneistoffe.
Vom Replikationsprinzip zur PCR
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ahmt die Replikation im Reaktionsgefäß nach. Wie in der Zelle kopiert eine DNA-Polymerase einen Einzelstrang und braucht dafür einen Startpunkt. Anders als in der Zelle wird aber nicht das ganze Genom verdoppelt. Kopiert wird nur ein gezielt ausgewählter Abschnitt.
Die PCR läuft in Zyklen ab. Jeder Zyklus besteht aus drei Temperaturstufen:
- Denaturierung: Bei etwa 95 °C trennen sich die beiden Stränge der DNA.
- Anlagerung (Annealing): Bei 50 bis 65 °C binden zwei Primer an ihre komplementären Stellen.
- Verlängerung (Elongation): Bei 72 °C verlängert die DNA-Polymerase die Primer zu neuen Strängen.
Ein Thermocycler wiederholt diese Folge automatisch 25- bis 40-mal. Jeder neu gebildete Strang dient im nächsten Zyklus selbst als Vorlage. Deshalb verdoppelt sich der Zielabschnitt mit jedem Zyklus, die Menge wächst exponentiell.
\[N = N_0 \cdot 2^n\]
\(N_0\) ist die Zahl der Ausgangskopien, \(n\) die Zahl der Zyklen und \(N\) die Zahl der Kopien danach. Die Formel gilt für den Idealfall, dass sich jeder Zyklus vollständig verdoppelt.
Ein Beispiel: Aus 50 Kopien werden nach 20 Zyklen \(50 \cdot 2^{20} \approx 5{,}2 \cdot 10^7\) Kopien. In der Praxis sinkt die Ausbeute in späten Zyklen. Dann werden Primer und Bausteine knapp.
Prinzip der PCR
Die PCR vervielfältigt DNA-Abschnitte. Ihr Ziel ist ein definiertes Stück zwischen zwei bekannten Sequenzen, oft nur einige hundert Basenpaare lang. Das Produkt kann man anschließend in der Gelelektrophorese nachweisen, sequenzieren oder klonieren.
In der Zelle trennt die Helicase die beiden Stränge. In der PCR übernimmt das die Hitze. Bei 95 °C lösen sich die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren. Eine Helicase braucht die PCR deshalb nicht. Man kann sich die DNA wie einen Reißverschluss vorstellen, der sich beim Erhitzen von selbst öffnet. Beim Abkühlen würde er sich wieder schließen. Die Primer liegen aber in großem Überschuss vor und besetzen ihre Bindestellen zuerst.
Jede DNA-Polymerase hängt neue Nucleotide nur an ein freies 3’-OH-Ende. Der neue Strang wächst deshalb stets in 5’→3’-Richtung. Die beiden Primer sitzen auf gegenüberliegenden Strängen. Ihre 3’-Enden zeigen aufeinander zu. So wird genau der Bereich zwischen ihnen kopiert.
RNA lässt sich mit der PCR nicht direkt vermehren. Die PCR-Polymerase akzeptiert nur DNA als Matrize. Wer RNA vervielfältigen will, muss sie zuerst in DNA umschreiben. Genau das leistet die RT-PCR am Ende dieser Seite.
PCR-Ansatz
Ein PCR-Ansatz enthält nur, was die Polymerase zum Kopieren von DNA braucht. Vier Bestandteile sind unverzichtbar. Dazu kommt ein Puffer mit \(\ce{Mg^2+}\), das die Polymerase als Cofaktor benötigt.
Matrize und Primer
Die Matrize (Template) ist die Ausgangs-DNA mit dem gesuchten Abschnitt. Meist ist das doppelsträngige genomische DNA oder Plasmid-DNA. Schon wenige Kopien genügen.
Ein Primer ist ein kurzes, einzelsträngiges DNA-Oligonucleotid von etwa 18 bis 25 Nucleotiden. Er bindet komplementär an die Matrize und liefert das freie 3’-OH-Ende, an dem die Polymerase startet.
Die PCR braucht zwei Primer, je einen für jeden Strang. Sie begrenzen den Zielabschnitt links und rechts. Auch eine hitzestabile Polymerase kommt ohne Primer nicht aus. Ihre Stabilität betrifft nur die Haltbarkeit des Enzyms. Einen Strang aus dem Nichts beginnen kann keine DNA-Polymerase.
dNTPs
Die Bausteine sind die vier Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Sie enthalten Desoxyribose und Thymin, also genau die Bestandteile der DNA. Beim Einbau wird Pyrophosphat abgespalten. Das liefert die Energie für die neue Phosphodiesterbindung:
\[\ce{(DNA)_{n} + dNTP -> (DNA)_{n+1} + PP_i}\]
Thermostabile DNA-Polymerase
Das Enzym ist eine DNA-abhängige DNA-Polymerase. Es liest DNA und baut DNA. Außerdem muss es thermostabil sein, denn jeder Zyklus erhitzt den Ansatz auf 95 °C. Die Polymerase aus Escherichia coli würde dabei denaturieren. Die klassische Wahl ist die Taq-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Ihr Arbeitsoptimum liegt bei etwa 72 °C. Deshalb muss man nicht nach jedem Zyklus frisches Enzym zugeben.
Die Bestandteile eines PCR-Ansatzes werden im Examen gerne gefragt. Sicher sitzen muss: DNA-Matrize, zwei einzelsträngige Primer, dATP, dCTP, dGTP, dTTP und eine thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase. Achte bei Nucleotiden auf das „d“ und bei Enzymen darauf, ob sie wirklich DNA an DNA kopieren.
Was nicht hineingehört
Andere Enzyme und Bausteine dienen Vorgängen, die in der PCR gar nicht stattfinden. Ordnet man jedes Molekül seinem Prozess zu, erkennt man die überflüssigen sofort:
| Komponente | Normale Aufgabe | Warum in der PCR überflüssig |
|---|---|---|
| NTPs (ATP, CTP, GTP, UTP) | Bausteine der RNA | Es entsteht DNA aus dNTPs |
| DNA-abhängige RNA-Polymerase | Transkription | Es wird keine RNA gebildet |
| DNA-Ligase | verknüpft DNA-Enden | Die Polymerase baut durchgehende Stränge |
| Restriktionsendonuclease | schneidet an Erkennungssequenzen | Die Primer legen die Grenzen fest |
| Aminoacyl-tRNA-Synthetase | belädt tRNA für die Translation | Es wird kein Protein gebildet |
| Helicase | entwindet den Doppelstrang | Die Hitze trennt die Stränge |
Die PCR ist eine reine Kopiermaschine: DNA rein, DNA raus. In den Ansatz gehört nur, was DNA an einer DNA-Vorlage verlängert.
cDNA-Synthese
cDNA (komplementäre DNA) ist eine DNA-Kopie einer RNA. Sie entsteht durch reverse Transkription. Das Enzym dafür ist die reverse Transkriptase, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase. Sie stammt aus Retroviren, die man früher RNA-Tumorviren nannte. Im Labor nutzt man etwa die Enzyme aus dem Moloney-Mausleukämievirus (M-MLV) oder dem Vogel-Myeloblastosevirus (AMV).
Als Matrize dient mRNA, also bereits prozessierte RNA. DNA als Ausgangsmaterial braucht man nicht. Wie jede Polymerase benötigt die reverse Transkriptase einen Primer und dNTPs. Sie synthetisiert den neuen Strang in 5’→3’-Richtung. Als Primer eignet sich ein Oligo(dT)-Primer. Er paart mit dem Poly(A)-Schwanz am 3’-Ende fast jeder eukaryotischen mRNA.
- Primer anlagern: Oligo(dT) bindet an den Poly(A)-Schwanz der mRNA.
- Erststrang: Die reverse Transkriptase verlängert den Primer entlang der mRNA. Es entsteht ein RNA-DNA-Hybrid.
- RNA entfernen: Die RNA wird abgebaut, etwa durch die RNase-H-Aktivität der reversen Transkriptase oder durch Lauge.
- Zweitstrang: Eine DNA-Polymerase ergänzt den Gegenstrang zur doppelsträngigen cDNA.
Die Zutaten der cDNA-Synthese sind besonders prüfungsrelevant: mRNA, reverse Transkriptase, Primer und dNTPs, aber keine DNA-Vorlage. Auch hier entsteht ausschließlich DNA. NTPs und RNA-Polymerase würden RNA herstellen, also das Gegenteil des Ziels. Ligase und Restriktionsendonuclease braucht man erst, wenn die fertige cDNA in einen Vektor eingebaut wird. Für die Umschreibung selbst wird DNA weder geschnitten noch verknüpft.
Die mRNA ist bereits gespleißt. Deshalb enthält cDNA keine Introns. Sie besteht nur aus den aneinandergereihten Exons und ist kürzer als das genomische Gen.
Das macht cDNA zum Werkzeug für die Klonierung eukaryotischer Gene. Bakterien können nicht spleißen. Ein genomisches Gen mit Introns würden sie in ein unbrauchbares Protein übersetzen. Die intronfreie cDNA lässt sich dagegen über einen Vektor in Bakterien bringen und dort exprimieren. Schreibt man die gesamte mRNA einer Zelle um und kloniert alle Stücke, entsteht eine cDNA-Bibliothek. Sie enthält nur die Gene, die in diesem Gewebe abgelesen werden. Ohne reverse Transkriptase lässt sich keine cDNA-Bibliothek herstellen.
RT-PCR
Die RT-PCR koppelt beide Verfahren. Zuerst schreibt die reverse Transkriptase die RNA in cDNA um. Danach vervielfältigt eine normale PCR diese cDNA. So wird RNA auf einem Umweg der PCR zugänglich.
| Schritt | Enzym | Matrize → Produkt |
|---|---|---|
| Reverse Transkription | Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) | RNA → cDNA |
| Amplifikation | thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase | DNA → DNA |
Beide Schritte brauchen Primer und die dNTPs dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Eine RNA-abhängige RNA-Polymerase kommt dagegen nicht vor. Sie kopiert RNA an RNA, wie es manche RNA-Viren bei ihrer Vermehrung tun. Die RT-PCR soll aber DNA liefern, denn nur DNA kann die PCR-Polymerase vervielfältigen.
Die wichtigste Anwendung ist der Nachweis viraler RNA. Viele Viren tragen ein RNA-Genom, etwa SARS-CoV-2, Influenzaviren, das Hepatitis-C-Virus oder HIV. Ein Abstrich enthält oft nur wenige Viruspartikel. Erst Umschreibung und exponentielle Vermehrung machen sie nachweisbar. Bei HIV bestimmt man so die Viruslast im Blut, mehr dazu beim Vermehrungszyklus von HIV.
„RT“ steht in der RT-PCR für reverse Transkription. Die Real-Time-PCR (qPCR) misst dagegen die Produktmenge laufend während der Reaktion. Kombiniert man beides, spricht man von RT-qPCR, wie beim Corona-Test.
Quiz
Aussage 1
Die Taq-Polymerase ist eine DNA-abhängige DNA-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium \(Thermus\ aquaticus\).
Sie liest DNA als Matrize, baut DNA und übersteht die Denaturierung bei 95 °C.
Aussage 2
Bei der PCR trennt eine hitzestabile Helicase die beiden DNA-Stränge.
Die Strangtrennung erfolgt allein durch Erhitzen auf etwa 95 °C. Eine Helicase wird in der PCR nicht benötigt.
Aussage 3
Zum Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR wird eine RNA-abhängige RNA-Polymerase benötigt.
Die RT-PCR braucht eine reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) und eine DNA-abhängige DNA-Polymerase. Eine RNA-abhängige RNA-Polymerase würde RNA statt DNA erzeugen.
Aussage 4
Bei der PCR wächst der neu synthetisierte Strang in 5’→3’-Richtung.
DNA-Polymerasen hängen Nucleotide nur an ein freies 3’-OH-Ende an. Deshalb verläuft die Synthese immer 5’→3’.
Aussage 5
Ein PCR-Ansatz enthält neben den dNTPs auch ATP, CTP, GTP und UTP als Bausteine.
Ribonucleosidtriphosphate sind RNA-Bausteine. Die PCR baut DNA und benötigt nur dATP, dCTP, dGTP und dTTP.
Aussage 6
Eine aus reifer mRNA hergestellte cDNA enthält die Introns des zugehörigen Gens.
Die mRNA ist bereits gespleißt. Die cDNA enthält deshalb nur die Exons und keine Introns.
Aussage 7
Weil die Taq-Polymerase thermostabil ist, kann man bei der PCR auf Primer verzichten.
Thermostabilität betrifft nur die Haltbarkeit des Enzyms. Auch die Taq-Polymerase braucht Primer, weil keine DNA-Polymerase einen Strang neu beginnen kann.
Aussage 8
Für die Synthese von cDNA aus mRNA benötigt die reverse Transkriptase einen Primer und dNTPs.
Wie jede DNA-Polymerase braucht sie ein freies 3’-OH-Ende, etwa von einem Oligo(dT)-Primer, und Desoxyribonucleosidtriphosphate als Bausteine.
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