Ames-Test zur Prüfung auf Mutagenität
Der Ames-Test prüft mit Histidin-Mangelmutanten von Bakterien, ob ein Stoff Rückmutationen auslöst. So gibt er einen ersten Hinweis auf eine mögliche krebserzeugende Wirkung.
Das Wichtigste in Kürze
- Der Ames-Test ist ein bakterieller Test auf Mutagenität: Er misst, ob ein Stoff Rückmutationen auslöst.
- Testkeime sind Histidin-auxotrophe Mangelmutanten von Salmonella typhimurium (his⁻), daneben auch von E. coli, mit definierter Mutation.
- Eine Rückmutation macht den Keim wieder prototroph (Revertante his⁺), er wächst auf Minimalagar. Der Anteil der Revertanten gegenüber der Spontanrate ist das Maß.
- Leberhomogenat (S9-Mix) aus Rattenleber aktiviert Prüfsubstanzen metabolisch, etwa Benzo[a]pyren zum Diolepoxid.
- Ein positiver Befund ist ein Hinweis auf Kanzerogenität bei Säugern. Chromosomenmutationen erfasst der Test nicht.
Worum es geht
Bevor ein Arzneistoff auf den Markt kommt, muss geklärt sein, ob er das Erbgut verändert. Der Ames-Test ist ein schneller bakterieller Suchtest auf Mutagenität. Er gehört zu den Standarduntersuchungen der Arzneimittelsicherheit.
Prinzip und Testkeime
Der Ames-Test prüft, ob ein Stoff mutagen ist, also Mutationen auslöst. Er arbeitet mit Bakterien statt mit Säugerzellen. Grundlage sind zwei Begriffe zum Nährstoffbedarf eines Stammes.
Auxotroph ist ein Stamm, der einen Baustein wie eine Aminosäure nicht selbst herstellen kann und ihn aus dem Medium braucht. Prototroph ist ein Stamm, der wie der Wildtyp auf Minimalmedium wächst, weil er alle Bausteine selbst synthetisiert.
Testkeime
Klassische Testkeime sind Histidin-Mangelmutanten von Salmonella typhimurium (his⁻). Daneben dienen auch Mangelmutanten von Escherichia coli. Jeder Teststamm trägt eine definierte Mutation in einem Gen der Aminosäuresynthese. Ohne Histidin im Medium kann er deshalb nicht wachsen.
Rückmutation als Messprinzip
Ein Mutagen kann die defekte Stelle erneut verändern. Hebt eine solche Rückmutation den Defekt auf, gewinnt die Zelle die Histidinsynthese zurück. Sie ist wieder prototroph und heißt Revertante (his⁺). Nur Revertanten bilden auf histidinfreiem Minimalagar Kolonien.
Praktisch plattiert man die Bakterien mit der Prüfsubstanz auf Minimalagar mit einer Spur Histidin aus. Diese Spur erlaubt wenige Zellteilungen, damit sich eine Mutation ausprägen kann. Nach etwa 48 h zählt man die Kolonien. Auch ohne Prüfsubstanz entstehen einige spontane Revertanten. Die Kontrollplatte zeigt diese Spontanrate. Liegt die Kolonienzahl auf der Testplatte deutlich darüber, gilt der Stoff als mutagen. Das Maß ist also der Anteil der Revertanten, die Reversionsrate.
Wird im Examen gerne gefragt: Histidin-auxotrophe Salmonella-Mutanten revertieren unter einem Mutagen zur Prototrophie. Der Anteil dieser Revertanten misst das mutagene Potential. Achte darauf, dass Revertanten wachsen und gezählt werden, ihr Absterben ist kein Messwert.
Metabolische Aktivierung mit S9-Mix
Viele Stoffe werden erst im Körper mutagen. Den Bakterien fehlen die dafür nötigen Leberenzyme. Deshalb setzt man Leberhomogenat (S9-Mix) zu, meist aus Rattenleber. Es enthält unter anderem Cytochrom-P450-Enzyme. So erfasst der Test auch mutagene Metaboliten. Ein Beispiel ist Benzo[a]pyren: Cytochrom P450 und Epoxidhydrolase wandeln es in das 7,8-Diol-9,10-epoxid um, das an Guanin bindet. Mehr dazu unter metabolische Aktivierung von Mutagenen.
![Strukturformeln von Benzo[a]pyren und seinem Diolepoxid mit Reaktionspfeilen und Enzymangaben.](img/abb-03.svg)
Der S9-Mix liefert nur die Enzyme zur Aktivierung. Die Mutagenität wird weiterhin an den Bakterien gemessen, nicht an Leberzellen.
Aussagekraft und Grenzen
Mutagenität und Krebsentstehung hängen eng zusammen, denn viele Kanzerogene schädigen die DNA. Ein Stoff, der die Testbakterien mutiert, kann daher auch für Säuger cancerogen sein. Der Ames-Test liefert so einen Hinweis auf potentielle Kanzerogenität, aber keinen Beweis.
Seine Grenzen ergeben sich aus dem Prinzip. Er misst die Reparatur eines einzelnen Synthesegens, also Genmutationen auf kleinem Raum. Chromosomenmutationen weist er deshalb nicht nach.
Auch die akute Toxizität eines Stoffes beurteilt der Test nicht. Er fragt nach Veränderungen des Erbguts, nicht nach Giftigkeit. Ebenso wenig prüft er Resistenzeigenschaften von Bakterien. Die Bakterien sind hier Messinstrument, nicht Untersuchungsgegenstand.
Quiz
Aussage 1
Im Ames-Test zeigt sich das mutagene Potential eines Stoffes am Anteil der Testkeime, die zur Prototrophie zurückmutiert sind.
Gezählt werden die his⁺-Revertanten, die auf Minimalagar Kolonien bilden. Ihr Anteil über der Spontanrate ist das Maß.
Aussage 2
Durch Zusatz von Rattenleber-Homogenat (S9-Mix) erfasst der Ames-Test auch Stoffe, die erst als Metaboliten mutagen wirken.
Der S9-Mix liefert Enzyme wie Cytochrom P450, die Prüfsubstanzen wie Benzo[a]pyren zu DNA-reaktiven Produkten aktivieren.
Aussage 3
Der Ames-Test eignet sich zum Nachweis von Chromosomenmutationen wie Translokationen.
Der Test erfasst nur Rückmutationen in einem Synthesegen, also Genmutationen. Chromosomenmutationen weist er nicht nach.
Aussage 4
Als Testkeime dienen im Ames-Test Salmonellen, die Histidin selbst synthetisieren und auf Minimalmedium wachsen.
Die Testkeime sind Histidin-auxotroph (his⁻) und wachsen ohne Histidin nicht. Erst nach einer Rückmutation werden sie prototroph.
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