Klonierungsvektoren, Selektionsmarker und DNA-Transfer
Wie Plasmide, Phagen und Viren als Vektoren Fremd-DNA tragen, wie man Zellen mit Vektor über Resistenzgene herausfiltert und auf welchen Wegen DNA in Zellen gelangt.
Das Wichtigste in Kürze
- Ein Klonierungsvektor ist ein DNA-Träger, der Fremd-DNA in eine Wirtszelle bringt und dort vermehrt wird; genutzt werden Plasmide, Bakteriophagen und Viren.
- Der Replikationsursprung (ori) ist die funktionelle Plasmidsequenz, an der die Replikation startet.
- Plasmide nehmen Fremdgene auf, nachdem sie mit einer Restriktionsendonuclease geöffnet wurden.
- Ein plasmidcodiertes Antibiotikaresistenzgen wie bla ist der Selektionsmarker: Auf Ampicillin-Agar wachsen nur plasmidtragende Zellen.
- Bakterien werden durch Transformation mit Plasmiden beladen; Elektroporation, Liposomen und Mikroinjektion in Säugetierzellen sind weitere Transferwege.
Worum es geht
Ein Gen allein vermehrt sich in keiner Zelle. Es braucht einen Träger, der sich selbst repliziert, und einen Weg in die Zelle hinein. Beides ist Grundlage jeder gentechnischen Herstellung, etwa von rekombinantem Humaninsulin in Escherichia coli.
Vektoren
Ein Vektor ist das Transportmittel der Gentechnik. Als Vektoren dienen Plasmide, Bakteriophagen und Viren. Alle drei können fremde Gene in Wirtszellen einschleusen. Phagen nutzt man für Bakterien, Viren vor allem für eukaryotische Zellen. Wie Phagen gebaut sind, steht bei den Bakteriophagen.
Ein DNA-Molekül, das Fremd-DNA aufnimmt, in eine Wirtszelle bringt und dort zusammen mit ihr vermehrt wird. Der Standardfall ist ein Plasmid.
Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle neben dem Bakterienchromosom. Für die Klonierung braucht ein Plasmid drei funktionelle Elemente. Der Replikationsursprung (ori) ist die DNA-Sequenz, an der die Replikation startet. Nur mit ori wird das Plasmid in der Zelle eigenständig kopiert und bei der Teilung weitergegeben.
Das zweite Element ist die Klonierungsstelle. Hier schneidet eine Restriktionsendonuclease den Ring auf. In die Lücke setzt man das Fremdgen ein, das mit demselben Enzym geschnitten wurde. Die Ligase verknüpft beide Stücke zum rekombinanten Plasmid. Den Ablauf im Ganzen zeigt die DNA-Klonierung.
Das dritte Element ist der Selektionsmarker. Meist ist das ein plasmidcodiertes Antibiotikaresistenzgen, etwa bla für die β-Lactamase gegen Ampicillin. Nach dem Gentransfer hat nur ein kleiner Teil der Bakterien ein Plasmid aufgenommen. Streicht man alle auf ampicillinhaltigen Agar aus, sterben die Zellen ohne Plasmid. Nur Zellen mit Resistenzplasmid und damit mit dem klonierten Gen bilden Kolonien. Der Marker wirkt also wie ein Sieb, das die Treffer zurückhält.
Wird im Examen gerne gefragt: Der ori ist die funktionelle Sequenz für die Replikation des Plasmids. Das plasmidcodierte Antibiotikaresistenzgen dient als Selektionsmarker für transformierte Zellen, die das klonierte Gen tragen.
Methoden des DNA-Transfers
Der Vektor muss durch die Zellmembran. Bakterien nehmen Plasmide durch Transformation auf. Im Labor macht man sie dafür mit Calciumchlorid durchlässig und setzt einen kurzen Hitzeschock. Die natürliche Form beschreibt die Einheit Transformation und Transduktion.
Bei der Elektroporation öffnen kurze elektrische Pulse vorübergehend Poren in der Membran. Durch sie gelangt die DNA ins Zellinnere. Das funktioniert bei Bakterien, Hefen und tierischen Zellen. Liposomen sind Lipidbläschen, die DNA einschließen und mit der Zellmembran verschmelzen (Lipofektion). Bei der Mikroinjektion spritzt man DNA mit einer feinen Glaskapillare direkt in den Zellkern. Das gelingt bei großen Zellen wie Säugetierzellen oder befruchteten Eizellen. Bakterien sind dafür zu klein und werden in der Regel transformiert.
| Methode | Prinzip | Typische Zielzellen |
|---|---|---|
| Transformation | Aufnahme freier Plasmid-DNA, z. B. nach Hitzeschock | Bakterien |
| Elektroporation | elektrische Pulse öffnen Membranporen | Bakterien, Hefen, tierische Zellen |
| Liposomen | Lipidvesikel verschmilzt mit der Membran | eukaryotische Zellen |
| Mikroinjektion | Glaskapillare injiziert in den Zellkern | Säugetierzellen, Eizellen |
Transformation meint die Aufnahme freier DNA, etwa eines Plasmids. Bringt ein Phage seine DNA in ein Bakterium, ist das eine Infektion, und überträgt er dabei Bakteriengene, heißt das Transduktion.
Quiz
Aussage 1
Nach einer Transformation mit einem Plasmid, das das bla-Gen trägt, bilden auf ampicillinhaltigem Agar nur plasmidtragende Bakterien Kolonien.
Das Resistenzgen ist der Selektionsmarker; Zellen ohne Plasmid werden durch Ampicillin abgetötet.
Aussage 2
Fremd-DNA wird in Bakterien üblicherweise per Mikroinjektion mit einer Glaskapillare eingebracht.
Bakterien sind dafür zu klein und werden in der Regel transformiert. Mikroinjektion nutzt man bei großen Zellen wie Säugetierzellen und Eizellen.
Aussage 3
Gelangt Phagen-DNA durch Infektion in ein Bakterium, bezeichnet man diesen Vorgang als Transformation.
Transformation ist die Aufnahme freier DNA wie eines Plasmids. Phagen-DNA gelangt durch Infektion in die Zelle, die Übertragung von Bakteriengenen durch Phagen heißt Transduktion.
Aussage 4
Der Replikationsursprung (ori) sorgt dafür, dass ein Plasmid in der Wirtszelle eigenständig kopiert wird.
Am ori startet die Replikation; ohne ori würde das Plasmid bei der Zellteilung verloren gehen.
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