Restriktionsenzyme, CRISPR/Cas und Gelelektrophorese
Wie Restriktionsendonucleasen und CRISPR/Cas DNA gezielt schneiden und wie man die entstehenden Fragmente im Gel nach ihrer Größe trennt.
Das Wichtigste in Kürze
- Restriktionsendonucleasen sind bakterielle Nucleasen, die doppelsträngige DNA an spezifischen Erkennungssequenzen schneiden und so Fremd-DNA abwehren.
- Sie sind Hydrolasen (Esterasen), spalten die Phosphodiesterbindung und liefern DNA-Fragmente. Die N-glykosidische Bindung bleibt erhalten.
- Sie schneiden DNA jeder Herkunft, von Bakterien und Phagen bis zu Pflanzen und Säugetieren, in der Regel aber keine RNA. Die Fragmente sind unterschiedlich lang.
- EcoRI schneidet GAATTC versetzt und erzeugt sticky ends mit AATT-Überhang, SmaI schneidet glatt.
- CRISPR/Cas ist ein bakterielles Abwehrsystem, bei dem eine Leit-RNA die Nuclease Cas9 zur Zielsequenz neben dem PAM führt.
- In der Gelelektrophorese wandert DNA bei pH 8 zur Anode. Kleine Fragmente laufen weiter, die Größe ergibt sich aus dem Vergleich mit einem Marker.
Worum es geht
Restriktionsenzyme, CRISPR/Cas und die Gelelektrophorese bilden das Grundwerkzeug der Gentechnik. Mit ihnen schneidet man DNA an definierten Stellen und prüft das Ergebnis. Ohne sie gäbe es weder rekombinantes Insulin noch moderne Gentherapien.
Nucleasen als Werkzeuge
Nucleasen sind Enzyme, die Nucleinsäuren spalten. Ihr Angriffspunkt ist das Rückgrat der DNA. Dort verknüpft eine Phosphodiesterbindung die 3’-OH-Gruppe einer Desoxyribose über ein Phosphat mit der 5’-OH-Gruppe der nächsten. Den Bau der DNA findest du bei Nucleoside, Nucleotide und ATP.
Nach dem Angriffsort unterscheidet man zwei Gruppen. Eine Exonuclease baut den Strang vom Ende her ab und setzt Nucleotid für Nucleotid frei. Eine Endonuclease schneidet mitten im Strang und hinterlässt längere Stücke.
Die wichtigsten Endonucleasen der Molekularbiologie stammen aus Bakterien. Dort zerschneiden sie eindringende Fremd-DNA, etwa das Erbgut von Phagen, und schränken so deren Vermehrung ein. Daher der Name Restriktionsendonuclease. Wie das Bakterium die eigene DNA schützt, steht bei den Bakteriophagen. Ein zweites bakterielles Abwehrsystem, CRISPR/Cas, ist heute das wichtigste Werkzeug der Genom-Editierung.
Enzymklasse und Spaltprodukt
Restriktionsendonucleasen sind Nucleasen und gehören zur Enzymklasse der Hydrolasen (siehe Enzymklassen). Sie spalten eine Esterbindung unter Einbau von Wasser. Genauer zählen sie deshalb zu den Esterasen. Ihr Substrat ist die Phosphodiesterbindung im Zucker-Phosphat-Rückgrat.
\[\ce{R-O-P(O)(O^-)-O-R' + H2O -> R-OH + HO-P(O)(O^-)-O-R'}\]
Dabei steht R für die Desoxyribose auf der 3’-Seite, R’ für die auf der 5’-Seite. Ein Fragment endet also mit einer freien 3’-OH-Gruppe, das andere mit einem 5’-Phosphat. Die N-glykosidische Bindung zwischen Zucker und Base bleibt unberührt. Nach dem Schnitt sitzen alle Basen noch an ihrer Desoxyribose.
Eine Endonuclease schneidet nur an wenigen Stellen im Strang. Es entstehen deshalb DNA-Fragmente mit oft Hunderten bis Tausenden Basenpaaren. Einzelne Desoxynucleotide setzen erst Exonucleasen frei. Die Einordnung als Hydrolase mit der Phosphodiesterbindung als Substrat wird im Examen gerne gefragt; achte darauf, dass die Produkte Fragmente sind und keine Monomere.
Die Tabelle grenzt Restriktionsenzyme von verwandten Hydrolasen ab.
| Enzym | gespaltene Bindung | Produkt |
|---|---|---|
| Restriktionsendonuclease | Phosphodiesterbindung im Strang | DNA-Fragmente |
| 3’-Exonuclease | Phosphodiesterbindung am 3’-Ende | einzelne Desoxynucleotide |
| DNA-Glykosylase | N-glykosidische Bindung | freie Base und basenlose Stelle |
| Protease | Peptidbindung | Peptide und Aminosäuren |
Erkennungssequenz und Substrate
Eine Restriktionsendonuclease schneidet nicht irgendwo. Sie erkennt eine kurze, festgelegte Basenfolge, die Erkennungssequenz. Meist umfasst sie 4 bis 8 Basenpaare und ist palindromisch: Beide Stränge lesen sich in 5’→3’-Richtung gleich. Man kann sich das Enzym wie einen Schlüssel vorstellen, der nur in ein bestimmtes Schloss passt.
Das Enzym erkennt seine Sequenz in der Regel nur in doppelsträngiger DNA. RNA und Einzelstrang-DNA spaltet es normalerweise nicht. Die Herkunft der DNA spielt dagegen keine Rolle. Bakterien-, Phagen-, Virus-, Pflanzen- und Säugetier-DNA werden ebenso geschnitten wie Plasmide. Ob die Sequenz in einem Gen oder zwischen zwei Genen liegt, ist dem Enzym gleich.
Die Erkennungssequenzen sind unregelmäßig über die DNA verteilt. Deshalb entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge. Ein Chromosom oder ein Plasmid wird nur an diesen bestimmten Stellen geschnitten. Das Fragmentmuster ist für eine DNA daher charakteristisch. So lässt sich DNA mit Restriktionsenzymen charakterisieren, etwa über Restriktionskarten oder den Vergleich von Bandenmustern im Gel.
Besonders prüfungsrelevant: Restriktionsendonucleasen schneiden doppelsträngige DNA jeder Herkunft, auch menschliche und pflanzliche, an spezifischen Erkennungssequenzen. Achte darauf, dass sie in der Regel keine RNA spalten und keine Bruchstücke gleicher Länge liefern.
Je nach Enzym entstehen zwei Arten von Enden. EcoRI aus Escherichia coli erkennt GAATTC und schneidet in beiden Strängen zwischen G und A. Die Schnitte liegen versetzt. Jedes Fragment trägt deshalb einen einzelsträngigen 5’-Überhang mit der Sequenz AATT. SmaI schneidet CCCGGG dagegen genau in der Mitte beider Stränge und erzeugt glatte Enden (blunt ends).
Sticky ends sind kurze, einzelsträngige Überhänge an den Enden eines Restriktionsfragments. Überhänge desselben Enzyms sind komplementär und lagern sich per Basenpaarung wieder zusammen.
Diese klebrigen Enden nutzt man, um Fragmente verschiedener Herkunft zu verknüpfen. Wie das geht, zeigt die Einheit zur rekombinanten DNA.
CRISPR/Cas
Auch CRISPR/Cas ist ein bakterielles Abwehrsystem gegen Fremd-DNA. CRISPR steht für clustered regularly interspaced short palindromic repeats. In diesen Abschnitten seines Genoms speichert das Bakterium kurze Stücke früherer Phagen-DNA als Gedächtnis. In RNA umgeschrieben, führen sie eine Cas-Nuclease zur passenden Fremd-DNA. Diese wird dann gezielt geschnitten.
Der Unterschied zu Restriktionsenzymen liegt in der Erkennung. Ein Restriktionsenzym erkennt seine Sequenz mit dem Protein selbst. Cas9 ist dagegen eine RNA-geleitete Nuclease. Eine Leit-RNA paart mit etwa 20 Basen der Ziel-DNA. Zusätzlich braucht Cas9 ein kurzes PAM-Motiv direkt neben der Zielsequenz, bei Cas9 aus Streptococcus pyogenes die Folge NGG. Dort schneidet es beide Stränge.
Für die Genom-Editierung ersetzt man die natürliche RNA durch eine synthetische Leit-RNA (sgRNA). Cas9 lässt sich so auf nahezu jede Stelle im Genom programmieren. Den Doppelstrangbruch repariert die Zelle selbst. Eine fehlerhafte Reparatur schaltet das Gen oft aus. Mit einer zugegebenen DNA-Vorlage lässt sich gezielt eine neue Sequenz einbauen. Auf diesem Prinzip beruht die inzwischen zugelassene Gentherapie Exagamglogen-Autotemcel gegen Sichelzellkrankheit und β-Thalassämie.
Gelelektrophorese
Die Gelelektrophorese trennt DNA-Fragmente nach ihrer Größe. Jedes Nucleotid trägt im Rückgrat eine Phosphatgruppe, die bei pH 8 negativ geladen ist. Im elektrischen Feld wandert DNA deshalb zur Anode. Die Probentaschen liegen entsprechend am Kathodenende des Gels.
DNA ist negativ geladen und läuft zum Pluspol, der Anode. Eselsbrücke: „Run to red“, denn die Anode ist meist rot markiert.
Als Matrix dient ein Gel aus Agarose oder Polyacrylamid. Es wirkt wie ein Sieb: Kleine Fragmente schlüpfen leichter durch die Poren und laufen weiter. Die Ladung pro Länge ist bei DNA nahezu konstant. Die Laufstrecke hängt daher fast nur von der Größe ab. Agarose eignet sich für größere Fragmente. Polyacrylamid trennt kleine Fragmente sehr fein und dient auch zur Trennung von Proteinen.
Zur Größenbestimmung läuft ein Größenmarker mit Fragmenten bekannter Länge mit. Ein DNA-Farbstoff macht die Banden sichtbar. Man liest die Probenbanden an der Markerleiter ab, im Beispiel bei 1800 und 4200 bp. Die Laufstrecke verhält sich dabei etwa linear zum Logarithmus der Fragmentlänge. Auch Produkte der PCR prüft man auf diese Weise.
Quiz
Aussage 1
Beim Verdau eines Plasmids mit einer Restriktionsendonuclease entstehen überwiegend einzelne Desoxynucleotide.
Als Endonuclease schneidet das Enzym nur an wenigen Stellen im Strang und liefert DNA-Fragmente. Einzelne Desoxynucleotide setzen Exonucleasen frei.
Aussage 2
Restriktionsendonucleasen bevorzugen einzelsträngige RNA als Substrat.
Restriktionsendonucleasen spalten in der Regel doppelsträngige DNA. RNA wird normalerweise nicht gespalten.
Aussage 3
EcoRI schneidet seine Erkennungssequenz versetzt und hinterlässt einzelsträngige 5’-Überhänge.
EcoRI schneidet GAATTC in beiden Strängen zwischen G und A. Es entstehen sticky ends mit dem Überhang AATT.
Aussage 4
Da Restriktionsenzyme aus Bakterien stammen, können sie menschliche DNA nicht schneiden.
Die Herkunft der DNA spielt keine Rolle. Entscheidend ist allein die Erkennungssequenz in doppelsträngiger DNA, daher wird auch Säugetier-DNA geschnitten.
Aussage 5
Bei Cas9 legt eine Leit-RNA durch Basenpaarung fest, an welcher Stelle die DNA geschnitten wird.
Cas9 ist eine RNA-geleitete Nuclease. Die Leit-RNA paart mit der Zielsequenz neben dem PAM, dort schneidet Cas9 beide Stränge.
Aussage 6
In einem Agarosegel bei pH 8 wandern DNA-Fragmente zur Kathode, große Fragmente laufen am weitesten.
Die negativ geladene DNA wandert zur Anode, und kleine Fragmente laufen weiter als große.
Aussage 7
Restriktionsendonucleasen zählen zu den Hydrolasen und spalten Phosphodiesterbindungen im DNA-Rückgrat.
Sie hydrolysieren die Esterbindung zwischen Zucker und Phosphat und gehören damit zu den Hydrolasen (Esterasen).
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