Molekularbiologische Methoden

Herstellung rekombinanter DNA und DNA-Klonierung

Wie man ein Gen gewinnt, es mit Restriktionsendonuclease und DNA-Ligase in ein Plasmid einbaut und in einer Wirtszelle vervielfältigt.

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Das Wichtigste in Kürze5 Punkte
  • Rekombinante DNA ist im Labor aus Abschnitten verschiedener Herkunft zusammengesetzte DNA, etwa ein Plasmid mit Fremdgen. Die DNA-Klonierung vervielfältigt damit ein DNA-Fragment in lebenden Zellen.
  • Gene gewinnt man durch Schneiden genomischer DNA mit Restriktionsendonucleasen, durch chemische Oligonucleotidsynthese mit Ligation oder in vitro mit DNA-Polymerase.
  • Die Restriktionsendonuclease öffnet das Plasmid, die DNA-Ligase baut das Gen kovalent ein, die DNA-Polymerase synthetisiert DNA.
  • Reihenfolge der Klonierung und der Überexpression: Schneiden, Ligieren, Transformieren der Wirtszelle.
  • Die Vereinzelung von Zellen durch Verdünnen und die cDNA-Synthese aus mRNA sind keine DNA-Klonierung.

Worum es geht

Rekombinante DNA verbindet Erbgut verschiedener Herkunft in einem Molekül. Mit ihr vermehrt man Gene in Bakterien und lässt sie dort ablesen. So entstehen etwa Humaninsulin und Wachstumshormon in Escherichia coli.

Was ist rekombinante DNA?

Rekombinante DNA ist ein DNA-Molekül, das im Labor aus Abschnitten verschiedener Herkunft zusammengesetzt wurde. Typisch ist ein bakterielles Plasmid mit einem eingebauten Fremdgen. Das Plasmid dient als Vektor, also als Transportmittel in die Zelle. Mehr dazu unter Klonierungsvektoren.

Ein Klon ist eine Gruppe genetisch identischer Zellen oder Moleküle mit gemeinsamem Ursprung. Bei der DNA-Klonierung vervielfältigt man ein bestimmtes DNA-Fragment mithilfe rekombinanter DNA in lebenden Zellen. Jede Teilung der Wirtszelle kopiert das eingebaute Gen mit.

Ziel ist entweder eine große Zahl von Genkopien oder die Expression des Gens. Dann liest die Wirtszelle das Gen ab und bildet das Protein, bei großen Mengen spricht man von Überexpression.

Gewinnung des Gens

Vor der Klonierung braucht man das Gen als DNA. Dafür gibt es drei Wege.

Erstens kann man genomische DNA mit Restriktionsendonucleasen schneiden. Sie spalten an festen Erkennungssequenzen, und das passende Fragment wird isoliert.

Zweitens lässt sich ein Gen chemisch synthetisieren. Man baut kurze Oligonucleotide beider Stränge auf, die sich versetzt überlappen. Sie paaren sich zum Doppelstrang, und die DNA-Ligase schließt die verbleibenden Lücken.

Versetzt angeordnete kurze Stränge oben und unten, die zusammen einen Doppelstrang bilden; Pfeile markieren die Lücken, die die Ligase schließt.

Gensynthese aus überlappenden Oligonucleotiden mit anschließender Ligation.

Drittens kann eine DNA-Polymerase das Gen in vitro an einer Matrize synthetisieren. Diesen Weg nutzt auch die PCR.

Für die In-vitro-Synthese taugen nur Enzyme, die DNA bilden. Eine DNA-abhängige RNA-Polymerase liefert dagegen RNA. Die Aminoacyl-tRNA-Synthetase belädt tRNA mit Aminosäuren und gehört zur Translation. Auch die Hybridisierung mit dem zugehörigen Protein liefert kein Gen, denn Hybridisierung ist Basenpaarung zwischen Nucleinsäuren.

Benötigte Enzyme

Für rekombinante DNA braucht man drei Enzyme aus dem DNA-Stoffwechsel. Jedes hat eine klar umrissene Aufgabe.

Enzym Aufgabe
Restriktionsendonuclease schneidet Plasmid und Spender-DNA an der Erkennungssequenz, öffnet den Plasmidring
DNA-Ligase baut das DNA-Fragment in den Vektor ein, knüpft Phosphodiesterbindungen
DNA-Polymerase synthetisiert und vervielfältigt DNA, etwa das Insert

Schneidet man Plasmid und Gen mit demselben Restriktionsenzym, entstehen komplementäre sticky ends. Sie lagern sich über Basenpaarung zusammen. Diese Paarung hält aber nur locker. Erst die DNA-Ligase verbindet 3’-OH und 5’-Phosphat kovalent im Rückgrat, wie die Abbildung zeigt.

Doppelstrang-Ausschnitt mit zwei überhängenden Enden, die sich paaren, und zwei markierten Lücken im Zucker-Phosphat-Rückgrat, die von der Ligase geschlossen werden.

Sticky ends lagern sich über Basenpaarung an; erst die DNA-Ligase verbindet die Stränge kovalent.
🎯 Examensrelevant: Schneiden und Verbinden

Die Rollenverteilung wird im Examen gerne gefragt: Die Restriktionsendonuclease öffnet das Plasmid, die DNA-Ligase fügt das Gen ein. Achte darauf, dass das Verbinden von Plasmid und Gen nie Aufgabe des Restriktionsenzyms ist.

Enzyme anderer Stoffwechselwege haben hier keine Aufgabe, denn sie setzen an anderen Substraten an. Katalase zerlegt Wasserstoffperoxid, Lipasen spalten Fette, und Proteinkinasen phosphorylieren Proteine. Lyasen klingen wie Ligasen, spalten aber Bindungen, statt sie zu knüpfen. Die Aminoacyl-tRNA-Synthetase arbeitet in der Translation.

Ablauf der Klonierung

Die Klonierung eines Fremdgens folgt einer festen Reihenfolge. Jeder Schritt setzt den vorherigen voraus.

  1. Schneiden: Plasmid und Gen werden mit demselben Restriktionsenzym geschnitten.
  2. Ligieren: Die DNA-Ligase fügt das Gen in das geöffnete Plasmid ein. Es entsteht das rekombinante Plasmid.
  3. Transformieren: Die Wirtszelle, meist E. coli, nimmt das rekombinante Plasmid auf.
  4. Vermehren: Die Zelle teilt sich zur Kolonie, einem Klon mit vielen Kopien des Gens.

Flussdiagramm mit Plasmidring und Gen, Schere als Restriktionsenzym, Ligase verbindet beide zum rekombinanten Plasmid, das in eine Bakterienzelle gelangt, die sich zu einer Kolonie teilt.

DNA-Klonierung: Schneiden mit Restriktionsendonuclease, Ligieren mit DNA-Ligase, Transformieren der Wirtszelle, Vermehrung zum Klon.

Für die Überexpression eines Gens gilt dasselbe Schema. Man wählt dann einen Vektor, der das Gen in der Wirtszelle stark ablesen lässt.

💡 Merke

Erst schneiden, dann kleben, dann einschleusen: Restriktionsenzym, Ligase, Transformation.

Anders als der Name vermuten lässt, ist das Vereinzeln von Zellen durch Verdünnen einer Suspension keine DNA-Klonierung. Es entsteht zwar ein Zellklon, aber ohne rekombinante DNA. Auch das Umschreiben isolierter mRNA in doppelsträngige DNA ist nicht die Klonierung selbst. Diese cDNA-Synthese liefert höchstens das Gen, das man anschließend kloniert.

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Aussage 1

Das Einfügen des Gens in das geöffnete Plasmid katalysiert die Restriktionsendonuclease.

Die Restriktionsendonuclease öffnet nur das Plasmid. Das kovalente Verbinden von Plasmid und Gen übernimmt die DNA-Ligase.

Aussage 2

Eine DNA-abhängige RNA-Polymerase eignet sich zur In-vitro-Synthese eines Gens.

Sie bildet RNA statt DNA. Für die In-vitro-Synthese eines Gens nutzt man die DNA-Polymerase.

Aussage 3

Bei der Klonierung eines Fremdgens wird zuerst das Plasmid geschnitten, danach das Gen ligiert und zuletzt die Wirtszelle transformiert.

Das ist die feste Reihenfolge, die auch für die Überexpression eines Gens gilt.

Aussage 4

Chemisch synthetisierte, überlappende Oligonucleotide lassen sich mit DNA-Ligase zu einem vollständigen Gen verknüpfen.

Die Oligonucleotide paaren sich versetzt zum Doppelstrang, die Ligase schließt die Lücken.

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